仿生纳米酶纤维的制备方法及其在细胞治疗中的应用

本技术属于细胞治疗，尤其涉及仿生纳米酶纤维的制备方法及其在细胞治疗中的应用。

背景技术：

1、急性肝衰竭(alf)是一种具有广泛肝细胞坏死和肝功能急性恶化的危及生命的疾病。然而，目前除肝移植外，尚无令人满意的治疗方法。据报道，活性氧(reactive oxygenspecies,ros)的过度生成和过度积累是alf的早期病理特征，并与疾病的进展密切相关，原因包括诱导的氧化应激、炎症风暴和大量肝细胞坏死。因此，早期有效消除ros，避免肝细胞不可逆损伤，补充功能性肝细胞对alf的治疗至关重要。

2、虽然有效清除ros可以缓解局部恶劣的微环境，但alf中大量肝细胞坏死和肝功能丧失仍需要功能性肝细胞进行必要的代偿。然而，供体有限、细胞增殖不良、体外维持肝细胞功能困难等阻碍了其治疗应用。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,mscs)具有多谱系分化潜能、自我更新能力以及抗氧化和抗炎功能，可以方便地在体外分离和扩增。此外，mscs在临床应用中也表现出较低的免疫反应，且不存在伦理问题。研究证明，mscs可以通过多种细胞因子阶段诱导有效地分化为功能性肝细胞样细胞(hepatocyte-like cells,hlcs)。mscs来源的hlcs不仅具有抗炎活性，而且具有肝细胞特异性功能。因此，mscs来源的hlcs显示出作为肝细胞治疗替代细胞来源的巨大潜力。然而，有研究表明，大多数植入细胞在静脉注射后被肺内阻塞，或在脾内移植后被巨噬细胞/吞噬细胞清除。此外，alf肝脏的微环境是细胞治疗的一个关键考虑因素，细胞植入的炎症环境可引起移植细胞坏死和凋亡。

3、因此，亟需一种可有效清除ros、副作用低、可原位移植功能性细胞的载体或者药物。

技术实现思路

1、本技术提供了一种仿生纳米酶纤维的制备方法和仿生纳米酶纤维，可原位移植在损伤实体器官以调控其ros稳态，还能与负载功能细胞起到协同增效增强细胞治疗效果的作用，有效解决现有细胞治疗容易在静脉注射后被肺内阻塞，或在移植后被巨噬细胞/吞噬细胞清除的问题。

2、本技术第一方面提供了一种仿生纳米酶纤维的制备方法，包括：

3、将抗氧化金属纳米酶和生物可降解高分子聚合物，在溶剂条件下进行复合和纤维化，制得仿生纳米酶纤维；其中，所述抗氧化金属纳米酶负载在所述仿生纳米酶纤维上。

4、在一些实施例中，所述抗氧化金属纳米酶选自铜基纳米酶、金纳米酶、银纳米酶和铂纳米酶中的一种或多种。

5、作为优选，本技术所用的抗氧化金属纳米酶为铜基纳米酶cu nzs。根据文献《ultrasmall copper-based nanoparticles for reactive oxygen species scavengingand alleviation of inflammation related diseases》制备。

6、虽然铜基纳米酶cu nzs具有抗氧化能力，但是常规静脉注射铜基纳米酶往往导致器官分布不理想、治疗效果差以及引起副作用的缺陷，因此，本技术发现将铜基纳米酶cunzs与生物可降解高分子聚合物进行复合和纤维化，制备可原位移植的具有调控ros稳态的仿生抗氧化纳米纤维，有效解决铜基纳米酶器官分布不理想的缺点。

7、在一些实施例中，所述生物可降解高分子聚合物选自聚乳酸聚乙醇酸共聚物plga、聚己内酯pcl、聚乳酸pla和明胶中的一种或多种；

8、所述溶剂选自六氟异丙醇hfip、二氯甲烷和四氢呋喃中的一种或多种。

9、作为优选，所述生物可降解高分子聚合物为聚乳酸聚乙醇酸共聚物plga；所述溶剂为六氟异丙醇hfip。

10、更具体的，所述聚乳酸聚乙醇酸共聚物plga中，la/ga＝50/50，plga最大mw为100000。所述聚乳酸聚乙醇酸共聚物plga在体系中为10wt/v％。

11、在一些实施例中，所述纤维化选自静电纺丝、3d打印或旋涂。

12、作为优选，所述纤维化为静电纺丝；静电纺丝的电压参数：13kv，静电纺丝的给料速率0.6ml h-1。

13、具体的，本技术的仿生纳米酶纤维制备方法包括：将cu nzs和聚乳酸聚乙醇酸共聚物plga分散在六氟异丙醇hfip中，进行静电纺丝成纳米纤维。收集静电纺丝纳米纤维，并将其置于真空以去除残留溶剂。

14、本技术第二方面提供了一种仿生纳米酶纤维，包括所述制备方法制得的仿生纳米酶纤维。

15、本技术第三方面公开了所述制备方法制得的仿生纳米酶纤维或所述仿生纳米酶纤维在制备原位细胞移植药物中的应用。

16、本技术第四方面提供了一种原位细胞移植药物，包括：

17、仿生纳米酶纤维和负载有功能性细胞的载药凝胶；

18、其中，所述仿生纳米酶纤维为所述制备方法制得的仿生纳米酶纤维。

19、在一些实施例中，所述功能性细胞选自功能性肝细胞样细胞、治疗性干细胞、原代肝细胞和肝细胞系aml-12中的一种或多种；所述功能性细胞还包括内皮细胞；

20、所述载药凝胶选自脱细胞基质decm水凝胶、plga-peg-plga、天然高分子水凝胶和胶原蛋白水凝胶中的一种或多种。

21、在一些实施例中，所述功能性细胞还包括内皮细胞，即功能性肝细胞样细胞、治疗性干细胞、原代肝细胞和肝细胞系aml-12中的一种或多种与内皮细胞组合得到的功能性细胞。

22、在一些实施例中，所述天然高分子水凝胶为透明质酸等水凝胶。

23、作为优选，所述功能性细胞为功能性肝细胞样细胞，功能性肝细胞样细胞(hepatocyte-like cells,hlcs)由mscs通过多种细胞因子阶段诱导有效地分化得到。

24、具体的，hlcs具有与原代肝细胞相似的肝脏功能，并具有抗炎和促进再生作用。研究表明，肝细胞分化后，mscs来源的hlcs获得了肝细胞功能，包括alb形成、细胞色素p450酶活性、尿素分泌等。hlcs可以恢复肝脏氨和嘌呤代谢，降低转氨酶和氨水平，提高血清alb水平，在肝病治疗中比未分化mscs更有效。hlcs还减少了炎症因子il-1β、il-6和tnf-α的产生，以缓解ccl4诱导的alf小鼠的炎症。因此，通过细胞因子诱导hadmscs向肝系分化，获得用于治疗alf的hlcs。

25、作为优选，所述载药凝胶为脱细胞基质(decm)水凝胶，decm水凝胶提供了理想的3d环境，有利于提高功能性细胞的治疗作用。

26、更为优选，所述脱细胞基质水凝胶为肝脏脱细胞外基质(decm)水凝胶，肝脏脱细胞外基质(decm)水凝胶可为负载的功能性细胞提供类似天然肝脏的微环境，且无不良免疫反应。然而，该decm水凝胶的机械强度较弱，且损伤部位的恶劣微环境使得植入的功能性细胞难以发挥作用。本技术发现将具有调控ros稳态能力的仿生纳米酶纤维与载药凝胶组合可有效提高载药凝胶中功能性细胞的治疗作用。

27、本技术第五方面公开了所述原位细胞移植药物在制备治疗肝脏疾病药物中的应用。

28、在一些实施例中，所述实体器官疾病包括肝脏疾病、皮肤创伤或心肌损伤修复。

29、作为优选，所述肝脏疾病包括肝纤维化或急性肝衰竭。

30、本技术开发了一种抗氧化金属纳米酶负载生物可降解高分子聚合物的仿生纳米酶纤维，该仿生纳米酶纤维复合了氧化金属纳米酶后，具有明显的ros消除能力、良好的生物相容性和促血管生成作用。此外，本技术的仿生纳米酶纤维还可与载药凝胶组成的协同治疗平台，用于在实体器官中原位递送功能性细胞，以有效治疗实体器官疾病。本技术发现仿生纳米酶纤维可协同载药凝胶在实体器官中原位递送功能性细胞，一方面仿生纳米酶纤维对载药凝胶提供机械支撑，使后者在实体器官中提供3d环境以便功能性细胞发挥效果，另一方面仿生纳米酶纤维中的抗氧化金属纳米酶能有效清除ros可以缓解局部恶劣的微环境，避免功能性细胞受到损伤器官的氧化微环境的干扰，促进功能性细胞及时发挥功能，并在早期缓解氧化应激和炎症。本技术提供的原位细胞移植药物对实体器官损伤的治疗效果显著、高效，表现为减少细胞凋亡和组织坏死，增加细胞增殖和血管化。