胰腺干细胞及其用途的制作方法

本公开文本涉及干细胞及其在治疗和/或预防胰腺疾病或障碍中的治疗用途。本文提供了包含c-kit阳性胰腺干细胞的组合物以及制备和使用用于治疗和/或预防胰腺疾病或障碍的c-kit阳性胰腺干细胞的方法。

背景技术：

0、发明背景

1、胰腺既是内分泌腺也是外分泌腺。在其作为内分泌腺的功能中，它产生几种重要的激素，包括胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。胰岛素和胰高血糖素分别从β细胞和α细胞分泌，以调节碳水化合物、蛋白质和脂质代谢。外分泌胰腺包括导管和腺泡细胞，它们合成和分泌有助于食物消化的消化酶。与胰腺相关的疾病和障碍包括糖尿病、胰腺炎、胰腺外分泌功能不全和囊性纤维化。

2、1型糖尿病是一种当胰腺由于自身免疫应答而产生很少胰岛素或不产生胰岛素时发生的慢性医学病症。免疫系统破坏了胰腺中产生胰岛素的β细胞。1型糖尿病通常开始于幼年期或青年期，但可以在任何年龄发生。在美国、加拿大和欧洲，1型糖尿病占所有糖尿病病例的5％至10％。发生糖尿病的人有一种或多种使他们易感该疾病的基因。环境因素，如在生命早期对某些病毒和食物的暴露，可能会引发自身免疫应答。患有1型糖尿病的人患心血管疾病的风险增加，这可能导致心脏病发作、胸痛、卒中、和甚至死亡。

3、1型糖尿病需要定期监测血糖、调整生活方式和使用胰岛素治疗。一般来说，向患有1型糖尿病的人推荐强化胰岛素疗法，以保持血糖在严格控制中。强化胰岛素疗法的缺点包括：每天多次胰岛素注射或使用胰岛素泵；需要频繁检查血糖；需要协调日常活动；低血糖发作的风险增加；初始体重增加；和成本。胰岛素作用的有效性还取决于注射的胰岛素剂量、注射技术、注射部位、皮下血流量、来自打开瓶子的胰岛素效力、以及每个个体特有的因素。

4、2型糖尿病是一种会破坏身体使用葡萄糖的方式的慢性医学病症。在这种障碍中，胰腺不能制造足够的胰岛素，身体对正常或甚至高水平的胰岛素、或两者变得有抗性。这导致高血糖水平，如果不治疗这会导致问题。在美国、加拿大和欧洲，所有患有糖尿病的人中约90％患有2型糖尿病。2型糖尿病被认为是由遗传和环境因素共同引起的。许多患有2型糖尿病的人的家庭成员患有2型糖尿病或与糖尿病相关的其他医学问题，如高胆固醇水平、高血压或肥胖。在某些种族群体中发生2型糖尿病的可能性更大，如西班牙裔、非洲裔和亚裔血统的人。

5、2型糖尿病的治疗包括改变生活方式、自我护理措施以及定期给予胰岛素和其他药物。这些治疗可以使血糖水平保持接近正常水平，并使发生并发症的风险最小化。

6、胰腺炎是胰腺的炎症，并且当消化酶开始消化胰腺本身时发生。胰腺炎可以是急性的或慢性的。任一种形式都很严重，并且可能导致并发症。急性胰腺炎突然发生，并且通常在接收治疗后几天消失。它通常由胆结石引起。常见症状是上腹部剧烈疼痛、恶心和呕吐。治疗通常是住院几天以静脉内注射(iv)液体、抗生素和缓解疼痛的药物。慢性胰腺炎不会治愈或改善。随着时间的推移会变得更糟，并导致永久损伤。最常见的原因是大量饮酒。其他原因包括囊性纤维化和其他遗传性障碍、血液中高水平的钙或脂肪、一些药物和自身免疫病症。症状包括恶心、呕吐、体重减轻和油性粪便。治疗还可以是住院几天以iv液体、缓解疼痛的药物和营养支持。慢性胰腺炎是诸如胰腺癌、糖尿病和胰腺外分泌功能不全等其他障碍的风险因素。

7、胰腺外分泌功能不全(epi)是由于缺乏由胰腺制造的消化酶而不能正确消化食物。epi发现于患有囊性纤维化和舒-戴综合征(shwachman-diamond syndrome)的人类。它是由制造消化酶的胰腺细胞逐渐丧失引起的。慢性胰腺炎是人类epi的最常见原因。消化酶的损失导致营养的消化不良和吸收不良。

8、在患有囊性纤维化的个体中，在囊性纤维化跨膜传导调节因子(cftr)的突变导致在许多器官(包括胰腺)中的上皮流体输送的调节异常。所产生的纤维化和胰腺炎症可能引起营养不良和糖尿病。

9、某些类型的胰腺癌涉及异常发挥功能的细胞。例如，胰腺的腺泡细胞癌可能导致过度产生消化酶，引起诸如皮疹和关节疼痛等症状。作为另一个例子，功能类型的神经内分泌肿瘤大量分泌激素如胰岛素、胃泌素和胰高血糖素到血流中，这可能导致严重的症状如低血糖。外科手术是外分泌类型癌症的唯一治疗方法，但手术可能会损伤胰腺的正常部位。

10、因此，存在将从允许胰腺内的细胞修复、重建和/或再生的疗法受益的各种胰腺疾病和障碍。然而，从胰腺中鉴定、表征和分离胰腺干细胞仍然是难以捉摸的，并且关于是否存在这种干细胞还存在争议。因此，本领域中存在对鉴定胰腺干细胞的标志物的需求，该胰腺干细胞的标志物可以用于分离可以用于胰腺疾病或障碍的疗法中的此类干细胞。

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明的实施方案涉及干细胞以及制备和使用该干细胞的方法。

2、本发明的实施方案是基于在胰腺组织中具有干细胞典型特征的c-kit阳性细胞群体的发现。在该发现之前，还没有识别或分离来自胰腺组织的具有所有干细胞特征的一种细胞类型。干细胞的基本特性是在体外和体内自我更新、克隆形成和多能性。c-kit阳性胰腺细胞通常是未分化的和/或表达最低水平的胰岛素、c-肽、胰高血糖素和/或淀粉酶。

3、本发明的实施方案提供了替换被胰腺疾病或障碍例如但不限于1型糖尿病、2型糖尿病、胰腺炎、囊性纤维化、胰腺外分泌功能不全、胰性血液(hemosuccus pancreaticus)、胰腺先天性畸形(如胰腺分裂和环状胰腺)、和/或胰腺癌损伤的胰腺细胞的问题的解决方案。在一些方面，该问题通过以下方式来解决：在有需要的受试者中向有缺陷和/或受损的胰腺组织给予胰腺干细胞以便促进胰腺组织修复和/或再生以及治疗或预防胰腺疾病或障碍，例如但不限于，1型糖尿病、2型糖尿病、胰腺炎、囊性纤维化、胰腺外分泌功能不全、胰性血液、胰腺先天性畸形(如胰腺分裂和环状胰腺)、和/或胰腺癌。在一个实施方案中，通过将细胞植入患者体内来给予胰腺干细胞。

4、因此，在一个方面，本发明提供了治疗或预防有需要的受试者中的胰腺疾病或障碍的方法，该方法包括向该受试者给予分离的胰腺干细胞，其中该胰腺干细胞是从胰腺组织样本中分离的并且是c-kit阳性的。在一个实施方案中，胰腺组织样本从受试者获得。在一个实施方案中，胰腺干细胞产生胰腺的β细胞。在另一个实施方案中，胰腺干细胞的特征在于它们分化成内分泌细胞和/或外分泌细胞的能力。在进一步的实施方案中，分离的胰腺干细胞是未分化的和/或表达最低水平的胰岛素、c-肽、胰高血糖素、ck19和/或淀粉酶。

5、在一个实施方案中，通过本文描述的方法或组合物治疗的胰腺疾病或障碍是1型糖尿病。在另一个实施方案中，胰腺疾病或障碍是2型糖尿病。在另一个实施方案中，胰腺疾病或障碍是胰腺炎、囊性纤维化、胰腺外分泌功能不全、胰性血液、胰腺先天性畸形(如胰腺分裂和环状胰腺)、和/或胰腺癌。

6、在一个实施方案中，将所述分离的胰腺干细胞在给予至受试者之前在培养物中扩增。在一个实施方案中，将分离的胰腺干细胞在给予至受试者之前暴露于一种或多种细胞因子和/或生长因子。在另一个实施方案中，将分离的胰腺干细胞在给予至受试者之前暴露于干细胞因子(scf)、胰岛素样生长因子1(igf-1)、和/或肝细胞生长因子(hgf)。

7、在一个实施方案中，将分离的胰腺干细胞通过血管、胰腺导管给予至受试者或直接给予至组织。在另一个实施方案中，将分离的胰腺干细胞通过注射或通过导管系统或通过肝脏中注射给予至受试者。

8、在另一个方面，本发明提供包含治疗有效量的分离的胰腺干细胞和药学上可接受的载体的药物组合物，该药物组合物用于修复和/或再生胰腺的受损组织，其中所述分离的胰腺干细胞是c-kit阳性的。在一些实施方案中，胰腺干细胞是从胰腺组织分离的。在另一个实施方案中，分离的胰腺干细胞是自体的。

9、在一个实施方案中，分离的胰腺干细胞能够产生一种或多种胰腺细胞类型。在另一个实施方案中，一种或多种胰腺细胞类型包括外分泌细胞。在另一个实施方案中，一种或多种胰腺细胞类型包括内分泌细胞。在进一步的实施方案中，内分泌细胞是α细胞或β细胞。在又另一个实施方案中，分离的胰腺干细胞是未分化的和/或表达最低水平的胰岛素、c-肽、胰高血糖素、ck19和/或淀粉酶。

10、在一个实施方案中，组合物包含约106个分离的胰腺干细胞。在另一个实施方案中，将分离的胰腺干细胞在体外进行培养和扩增。在另一个实施方案中，组合物进一步包含一种或多种细胞因子和/或生长因子。在进一步的实施方案中，组合物进一步包含干细胞因子(scf)、igf-1和/或hgf。

11、在一个实施方案中，组合物被配制用于导管介导的注射或直接注射。

12、在另一个方面，本发明提供了一种从胰腺分离常驻胰腺干细胞的方法，该方法包括：(a)在培养物中培养来自所述胰腺的组织样本，从而形成组织外植体；(b)选择来自培养外植体的呈c-kit阳性的细胞，和(c)分离所述c-kit阳性细胞，其中所述分离的c-kit阳性细胞是常驻胰腺干细胞。

13、在一个实施方案中，所述分离的c-kit阳性细胞表达外分泌细胞和/或内分泌细胞的一种或多种标志物。在另一个实施方案中，一种或多种标志物包括胰岛素、c-肽、胰高血糖素、ck19和/或淀粉酶。

14、在从胰腺分离常驻胰腺干细胞的方法的一个实施方案中，分离的c-kit阳性细胞能够产生一种或多种胰腺细胞类型。在另一个实施方案中，一种或多种胰腺细胞类型包括外分泌细胞。在另一个实施方案中，一种或多种胰腺细胞类型包括内分泌细胞。在进一步的实施方案中，内分泌细胞是α细胞或β细胞。

15、在一个实施方案中，从胰腺分离常驻胰腺干细胞的方法进一步包括在培养物中扩增所述分离的c-kit阳性细胞。在另一个实施方案中，该方法进一步包括在培养物中将所述分离的c-kit阳性细胞暴露于一种或多种细胞因子和/或生长因子。在又另一个实施方案中，该方法进一步包括在培养物中将所述分离的c-kit阳性细胞暴露于干细胞因子(scf)、igf-1和/或hgf。

16、在另一个方面，本发明提供了一种修复和/或再生有需要的受试者中胰腺的受损组织的方法，该方法包括：从胰腺中提取胰腺干细胞；培养和扩增所述胰腺干细胞，所述胰腺干细胞是c-kit阳性干细胞；并且将一个剂量的所述提取和扩增的胰腺干细胞给予至受试者的受损组织区域，该剂量可有效修复和/或再生胰腺的受损组织。

17、在修复和/或再生有需要的受试者中的胰腺的受损组织的方法的一个实施方案中，提取和扩增的c-kit阳性干细胞表达外分泌细胞和/或内分泌细胞的一种或多种标志物。在另一个实施方案中，一种或多种标志物包括胰岛素、c-肽、胰高血糖素、ck19和/或淀粉酶。

18、在修复和/或再生有需要的受试者中的胰腺的受损组织的方法的一个实施方案中，提取和扩增的c-kit阳性干细胞能够产生一种或多种胰腺细胞类型。在另一个实施方案中，一种或多种胰腺细胞类型包括外分泌细胞。在另一个实施方案中，一种或多种胰腺细胞类型包括内分泌细胞。在进一步的实施方案中，内分泌细胞是α细胞或β细胞。

19、在修复和/或再生有需要的受试者中的胰腺的受损组织的方法的一个实施方案中，在培养物中将提取和扩增的c-kit阳性干细胞在给予至受损组织之前暴露于一种或多种细胞因子和/或生长因子。在又另一个实施方案中，将提取和扩增的c-kit阳性干细胞在给予至受损组织之前暴露于干细胞因子(scf)、igf-1和/或hgf。

20、在修复和/或再生有需要的受试者中的胰腺的受损组织的方法的一个实施方案中，将提取和扩增的c-kit阳性干细胞通过导管介导的注射或直接注射给予。

21、在所述组合物和方法的所有方面的一个实施方案中，胰腺组织来自人类。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，胰腺组织是成体胰腺组织。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，分离的胰腺干细胞是可形成克隆的、多能的和自我更新的。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，c-kit阳性细胞是可形成克隆的、多能的和自我更新的。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，分离的胰腺干细胞是未分化的和/或表达最低水平的胰岛素、c-肽、胰高血糖素、ck19和/或淀粉酶。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，胰腺干细胞是自体的。在所述组合物和方法的所有方面的另一个实施方案中，胰腺干细胞是同种异体的。