一种新型抗肺癌树突状细胞疫苗及其构建方法

本发明涉及抗肺癌疫苗。具体地说是一种新型抗肺癌树突状细胞疫苗及其构建方法。

背景技术：

1、免疫细胞治疗是未来肿瘤治疗的重要发展领域之一，树突状细胞作为免疫应答的起始环节，可以摄取肿瘤抗原并递呈给t淋巴细胞，进而有效活化抗原特异性细胞免疫反应，在肿瘤治疗中起着不可或缺的作用。因此，树突状细胞疫苗成为了肿瘤免疫细胞治疗的重要手段。

2、树突状细胞疫苗的构建步骤主要包括树突状细胞的诱导，肿瘤相关抗原刺激及细胞回输等步骤，回输的树突状细胞可在体内活化抗肿瘤免疫反应。尽管多个临床实验均证实了树突状细胞疫苗的安全性和免疫原性，但临床响应效果依然不理想。出现这种结果的原因主要是树突状细胞抗原递呈不充分、迁移能力过低以及免疫活化程度不足以对抗体内的免疫抑制环境。因此，目前多项研究致力于提高树突状细胞疫苗的抗原承载能力及活化水平，以期提高其体内的抗肿瘤效果。采用腺病毒携带外源基因转染树突状细胞，提高其肿瘤抗原的承载能力是较常见的操作。尽管提高树突状细胞的抗原承载能力可在一定程度上提高治疗效果，但由于病人体内通常是一个免疫抑制的内环境，常规的树突状细胞疫苗并无法克服回输后面临的肿瘤免疫抑制作用。因此，有必要设计一种新的抗肺癌树突状细胞疫苗构建方法，以解决这个问题。

技术实现思路

1、为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种新型抗肺癌树突状细胞疫苗及其构建方法，以解决现有抗肺癌树突状细胞疫苗大多针对提高树突状细胞的抗原承载能力，没有靶向其免疫抑制信号通路而被肿瘤细胞相关信号抑制的问题。

2、为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

3、一种新型抗肺癌树突状细胞疫苗，利用树突状细胞转染靶基因敲除慢病毒，并加入肿瘤抗原和佐剂组合刺激后进行组合刺激后得到。

4、上述新型抗肺癌树突状细胞疫苗，靶基因敲除慢病毒敲减的序列为靶基因pdcd10的ccaggatgttgaatgggat序列；加入的佐剂为tlr7/8激动剂r848和tlr3激动剂poly（i:c）。

5、一种新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法，包括如下步骤：

6、步骤（1）、利用生物信息学方法筛选树突状细胞中免疫抑制基因，确定靶基因；

7、步骤（2）、筛选靶基因中的靶向敲除序列，并制备靶基因敲除慢病毒；

8、步骤（3）、诱导分化获取树突状细胞；

9、步骤（4）、利用诱导分化的树突状细胞和靶基因敲除慢病毒构建新型抗肺癌树突状细胞疫苗。

10、上述新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法，步骤（1）中，生物信息学方法为：基于geo数据库，利用aracne算法建立树突状细胞状态转变的特异性调控网络；利用viper算法筛选调控树突状细胞从正常状态到失能状态转变的调控因子，确定具有免疫功能抑制作用的靶基因。

11、上述新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法，利用viper算法筛选调控树突状细胞从正常状态到失能状态转变的调控因子，确定具有免疫功能抑制作用的靶基因的方法为：

12、步骤（1-1）、整合下游靶标的调控模式，计算调控因子和靶标之间的统计置信度，并统计不同调控因子的靶标集合的重合程度，构建得到概率化框架；

13、步骤（1-2）、利用概率化框架计算各调控因子下游的靶标在差异表达基因上的富集情况，计算得到各调控因子的靶标富集得分；

14、步骤（1-3）、选取靶标富集得分在前20的调控因子，结合树突状细胞在肺癌微环境下状态变化的表达谱数据，筛选出表达差异较高的调控因子pdcd10，即选取pdcd10作为靶基因。

15、上述新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法，步骤（2）包括如下步骤：

16、步骤（2-1）、根据靶基因的全序列设计sirna序列；

17、步骤（2-2）、采用lipo3000将sirna转染至树突状细胞，在转染后的24h和48h分别收集细胞抽提总rna，反转录后用荧光定量pcr检测不同sirna对靶基因的敲减效果进行验证；

18、步骤（2-3）、根据敲减效果的验证结果，确定靶向敲除序列；

19、步骤（2-4）、构建靶向敲除序列敲减后的载体质粒；

20、步骤（2-5）、利用载体质粒包装制备得到靶基因敲除慢病毒。

21、上述新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法，步骤（4）包括如下步骤：

22、步骤（4-1）、取诱导分化的树突状细胞，加入靶基因敲除慢病毒以转染树突状细胞，获取靶基因稳定敲减的树突状细胞；

23、步骤（4-2）、转染结束后，加入肿瘤抗原，继续培养；

24、步骤（4-3）、向培养体系中加入佐剂后，继续培养；培养结束后即得到新型抗肺癌树突状细胞疫苗。

25、上述新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法，步骤（4-1）中，树突状细胞为诱导分化至第4天的树突状细胞；转染时间为24h；

26、步骤（4-2）中，肿瘤抗原的加入量以培养基中肿瘤抗原的质量浓度达到50μg/ml为标准，加入肿瘤抗原后继续培养24h；

27、步骤（4-3）中，佐剂为tlr7/8激动剂r848和tlr3激动剂poly（i:c）；加入佐剂后，培养基中r848的质量浓度为2.5μg/ml，poly（i:c）的质量浓度为25μg/ml；加入佐剂后继续培养48小时。

28、上述新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法，步骤（3）包括如下步骤：

29、步骤（3-1）、取外周血制备得到全血样品；

30、步骤（3-2）、将全血样品加入到ficoll细胞分离液中，使得全血样品和ficoll细胞分离液形成上下两层，然后离心；

31、步骤（3-3）、离心结束后，吸取离心管内的白膜层，获得单个核细胞，并将单个核细胞接种在培养板中；

32、步骤（3-4）、将培养板置于培养箱中培养，诱导分化获取树突状细胞。

33、上述新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法，步骤（3）的具体操作方法为：

34、步骤（3-1）、采集健康志愿者的外周血25ml，用生理盐水按照体积比1:1稀释后，用移液器上下吹打混匀，得到全血样品；

35、步骤（3-2）、取50ml的离心管加入10ml ficoll细胞分离液，沿着离心管的管壁在接近细胞分离液的液面处非常缓慢地加入全血样品，使得全血样品在ficoll细胞分离液上面(切记不要混)，接着于2000rpm的离心20分钟；

36、步骤（3-3）、取出离心管于超净工作台中，离心管中液体自上而下分为血浆层、白膜层（即外周血单个核细胞pbmc）和红细胞层，用巴氏吸管吸掉三分之二的血浆层，不要搅动；

37、用巴氏吸管吸取白膜层于50ml离心管中，加入生理盐水30ml并充分混匀，于2500rpm离心5分钟，弃上清，收集；重复此步骤3次，第3次用aim-v无血清培养基清洗,并计数；

38、在aim-v无血清培养基中加入il-4(peprotech)至其浓度为100ng/ml，加入gm-csf(peprotech)至其浓度为200ng/ml,得到树突状细胞培养基；按2×106cells/孔接种在24孔培养板中，每孔1ml培养基；

39、步骤（3-4）、将24孔培养板摇匀后，置于培养箱中，于37℃的温度下，5% co2浓度的环境下培养2.5h；培养结束后，取出培养板，收集悬浮细胞和培养基于新的15ml离心管中；

40、向去除了悬浮细胞和培养基的24孔培养板的各孔中重新加入1ml新鲜树突状细胞完全培养基继续于37℃的温度下，5% co2浓度的环境下培养；

41、培养72h后，取出24孔培养板，每孔吸去500μl旧培养基，并补充500μl新鲜的dc完全培养基，继续于37℃的温度下，5% co2浓度的环境下培养；

42、培养96h后结束培养，即获取得到诱导分化的树突状细胞。

43、本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：

44、本发明新型抗肺癌树突状细胞疫苗的构建方法简便高效，包括树突状细胞靶基因筛选，树突状细胞的培养，基因敲减及肿瘤抗原刺激，疫苗效果评估等技术手段。该方法操作简便，可显著提高树突状细胞疫苗的抗肿瘤活性，可对树突状细胞疫苗进行个性化订制，构建最符合病人需求的树突状细胞疫苗产品。本发明筛选的靶向树突状细胞的免疫抑制基因，可总体提高树突状细胞疫苗的活化及细胞因子分泌水平；敲减树突状细胞疫苗中的免疫抑制基因可显著提高其活化水平，增强肿瘤杀伤效果。本发明有效解决了现有抗肺癌树突状细胞疫苗大多针对提高树突状细胞的抗原承载能力，没有靶向其免疫抑制信号通路而被肿瘤细胞相关信号抑制的问题。