一种基于水凝胶的BMSCs载阿奇霉素新型制剂及其制备方法与应用

本发明涉及纳米制剂，特别涉及一种基于水凝胶的bmscs载阿奇霉素新型制剂的制备方法。

背景技术：

1、脊髓损伤(spinal cord injury，sci)是一种对中枢神经系统具有破坏性的创伤性疾病。每年有超过60万人因脊髓损伤而失去四肢的感觉和运动功能，严重时可导致身体残疾。因此，迫切需要加强对脊髓损伤的治疗研究。脊髓损伤通常有两种表现，一种为原发性损伤，一种为继发性损伤。原发性损伤是由机械性损伤(如外伤)直接引起的。随着时间的推移和多种生理病理变化，逐渐出现神经元损伤、炎症反应、脊髓脱髓鞘等一系列继发性事件，从而导致继发性损伤，加重患者的神经功能缺损。作为一种难以治愈的神经性疾病，脊髓损伤的治疗研究一直都受到各国科研爱好者的广泛关注。然而，目前国内外对sci的治疗除了药物治疗外，还采用过外科手术治疗和细胞移植等方式。但这些方式不仅治疗有限，而且还可能会损伤正常组织，从而加重患者的神经功能缺损。再加上脊髓损伤病理机制复杂，所以目前并没有治愈脊髓损伤的有效方法。目前临床上采用的这些策略往往难以使药物在脊髓损伤部位达到有效的治疗效果。全身给药后，药物在损伤部位的累积量极少，即使是具有屏障通透性的药物，通常也需要通过全身给药的方式，再加上高剂量治疗，才有可能在损伤部位勉强达到治疗水平；然而，这将导致有害的脱靶效应发生。综上，提高药物在脊髓损伤部位的有效治疗浓度，从而更好地促进神经修复和减少脊髓空洞化程度，是有效治疗脊髓损伤的关键。

2、阿奇霉素(azithromycin，azm)半衰期约为11h～17h，具有较低的毒副作用和较高的安全性，是目前最常用的抗生素之一。有研究指出，阿奇霉素能降低m1巨噬细胞基因表达，同时增加m2巨噬细胞基因表达，从而发挥抗炎作用，这为其应用于sci提供了理论基础。azm被报道在治疗sci患者感染时既安全又有效，然而，关于sci后azm治疗效果的研究非常有限，这可能与阿奇霉素在应用上存在生物利用度低、大剂量使用易造成毒副作用等有关。纳米制剂具有改善药物吸收、调节释药速率、促使药物更容易进入组织和毛细血管等特点，从一定程度上可以减少给药剂量，在难溶性药物的应用中展现出独特优势，正好可以解决目前临床上面临的问题。但是组成纳米制剂的各种物质在很大程度上会对目标递药系统的毒性产生影响。

3、因此，如何开发一种阿奇霉素纳米粒，既能克服阿奇霉素的自身缺陷和临床应用的局限性，又能解决纳米制剂的生物相容性、毒性问题，在提高药物递送效率的同时，又增强了疗效，成为亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明目的是提供一种基于水凝胶的bmscs载阿奇霉素新型制剂及其制备方法与应用，基于水凝胶的bmscs载阿奇霉素新型制剂结合阿奇霉素、白蛋白、骨髓间充质干细胞以及水凝胶的递药系统具有强大的治疗效果，既能克服阿奇霉素的自身缺陷和临床应用的局限性，又能解决纳米制剂的生物相容性、毒性问题，在提高药物递送效率的同时，又增强了疗效。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、在本发明的第一方面，提供了一种基于水凝胶的bmscs载阿奇霉素新型制剂，所述基于水凝胶的bmscs载阿奇霉素新型制剂由白蛋白-阿奇霉素-纳米粒依次被大鼠骨髓间充质干细胞、壳聚糖水凝胶包裹组成；其中，所述白蛋白-阿奇霉素-纳米粒、大鼠骨髓间充质干细胞、壳聚糖水凝胶的质量比为1∶1～2∶1～2；所述白蛋白-阿奇霉素-纳米粒为白蛋白包裹阿奇霉素形成的纳米粒，所述阿奇霉素与所述白蛋白的质量比为1∶4～5。

4、在本发明的第二方面，提供了一种基于水凝胶的bmscs载阿奇霉素新型制剂的制备方法，所述方法包括：

5、将主药阿奇霉素、辅料和三氯甲烷经超声溶解后，获得油相；将质量分数为1％～5％的人血清白蛋白溶液的ph值调至3.5～4.5后作为水相；将所述油相和所述水相混合后剪切，得到乳白色的初乳；将所述初乳经旋蒸除去三氯甲烷，获得白蛋白-阿奇霉素-纳米粒，即tat-azm-nps；

6、将所述白蛋白-阿奇霉素-纳米粒与大鼠骨髓间充质干细胞混匀后于培养箱共同孵育，后经消化、离心弃上清和加入新鲜培养基重悬，再加入壳聚糖水凝胶混匀后培养，获得基于水凝胶的bmscs载阿奇霉素新型制剂，即bmscs-tat-azm-nps@gel。

7、在本发明的第三方面，提供了所述的基于水凝胶的bmscs载阿奇霉素新型制剂在制备用于治疗脊髓损伤的药物中的应用。

8、本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

9、1、本发明提供的一种基于水凝胶的bmscs载阿奇霉素新型制剂，由疏水药物阿奇霉素依次被白蛋白载体、间充质干细胞载体和水凝胶包覆(药物释放需经过三层结构)组成，解决了阿奇霉素azm的毒副问题；提高bmscs作为药物载体的存活率和有效性以及对azm的摄取率，在体内外对大鼠脊髓损伤治疗效果，最终实现高效治疗脊髓损伤的目的。具体地：纳米制剂虽具有改善药物吸收、调节释药速率、促使药物更容易进入组织和毛细血管等特点，但在很大程度上会对目标递药系统的毒性产生影响，因此，选用毒性低、生物相容性好的人血清白蛋白作为制备纳米粒的材料；壳聚糖和β-甘油磷酸钠制备的水凝胶是一种性质温和、表面电荷几乎呈电中性的水凝胶；选择合适的纳米粒制备材料和水凝胶制备材料可以提高药物的稳定性和生物相容性，避免各制剂组在后续的体内实验中作用于bv2细胞和sh-sy5y细胞时出现免疫排斥反应、炎症反应以及加重的神经退行性疾病；阿奇霉素纳米粒虽具有抗炎、抗氧化以及神经保护的效果，但脊髓损伤是一种对中枢神经系统和脊髓组织具有严重破坏性的疾病，因此，在给药系统中加入骨髓间充质干细胞以发挥其组织修复作用；研究者们通常认为骨髓间充质干细胞在被移植和治疗的过程中的存活率较低，本技术发现加入可注射水凝胶形成组织工程支架可保护干细胞的存活率，用可注射水凝胶作为骨髓间充质干细胞载阿奇霉素人血清白蛋白纳米粒发挥药效的组织工程支架，使其在脊髓损伤部位高效、稳定、持续发挥治疗作用。通过实验结果发现，构建的结合阿奇霉素、骨髓间充质干细胞以及水凝胶的递药系统具有强大的治疗效果：大鼠bbb评分和体重指数变化表明该递药系统能改善大鼠后肢的运动功能；磁共振成像结果表明该递药系统能促进受损脊髓组织的修复；h&e染色结果表明该递药系统能改善受损脊髓组织的病理特征；nissl染色和tunnel染色表明该递药系统能减少神经细胞凋亡，促进神经保护作用；免疫组化结果表明该递药系统还能促进轴突的存活和再生。

10、相比于共价结合的方式，将阿奇霉素纳米粒包裹于骨髓间充质干细胞中，使阿奇霉素和干细胞形成一个整体，不仅能加强整个给药系统的稳定性，还能加强药物的缓释作用。

11、2、本发明提供的一种基于水凝胶的bmscs载阿奇霉素新型制剂的制备方法，将阿奇霉素制备成人血清白蛋白纳米粒(tat-azm-nps)，然后用骨髓间充质干细胞装载纳米粒(bmscs-tat-azm-nps)，再将载阿奇霉素人血清白蛋白纳米粒的骨髓间充质干细胞包裹在壳聚糖水凝胶中，通过共孵育法制备bmscs-tat-azm-nps@gel递药系统并采用live/dead细胞双染试剂盒染色对递药系统进行形成性验证，显微镜下观察到水凝胶附着于干细胞表面。实验结果表明，bmscs-azm-nps@gel在ph 7.4的pbs缓冲液中表现出良好的缓释效果。对各制剂组的体外释放行为进行了考察，azm-nps和tat-azm-nps体外释放过程前期处于突释期，这是由于纳米粒表面吸附的阿奇霉素和分布于外层的阿奇霉素快速释放而造成，随后进入释放的缓释期。而对于bmscs-tat-azm-nps和bmscs-tat-azm-nps@gel组，当纳米粒快速释放后，再进行扩散将变得困难，释放过程还要依赖于对bmscs的跨膜行为以及水凝胶的释放行为，从整个释药过程可以看出：与阿奇霉素原料药相比，bmscs-tat-azm-nps@gel可对药物起到良好的缓释作用，使其能够更好的发挥药物作用。

12、3、本发明用体外溶血实验考察bmscs-tat-azm-nps@gel的安全性，实验结果表明，所有制剂组均保持较低(＜5％)的溶血率，可用于后续实验的进行。通过mtt实验考察bmscs-tat-azm-nps@gel的细胞毒性，实验结果表明，随着给药浓度和给药时间的增加，bv2细胞和sh-sy5y细胞的存活率逐渐降低，但各给药组在不同浓度下存活率均高于80％，表明各给药组细胞毒性较低。利用elisa和griess试剂盒考察bmscs-tat-azm-nps@gel在体外的抗炎、抗氧化效果，检测结果显示，bmscs-tat-azm-nps@gel可通过降低炎症因子(il-6、tnf-α)和氧化因子(no)水平从而达到抗炎、抗氧化效果。本项目采用h2o2刺激sh-sy5y细胞，构建神经受损模型，再加以药物干预，从而对各制剂组的神经保护作用进行验证。实验表明，bmscs-tat-azm-nps@gel在体外具有神经保护作用。

13、4、本发明成功建立了利用高效液相色谱仪测定体内样品中阿奇霉素含量的色谱方法。研究bmscs-tat-azm-nps@gel的药物代谢动力学，实验结果显示，bmscs-tat-azm-nps@gel能有效地延缓药物在体内的停留时间以及提高药物的半衰期。利用小动物活体成像仪考察bmscs-tat-azm-nps@gel的体内分布情况，实验结果表明，bmscs-tat-azm-nps@gel能增强药物在病灶部位的浓集。采用荧光标记法考察bmscs-tat-dir-nps@gel的体内分布，结果表明，bmscs-tat-dir-nps@ge1能够有效地分布至脊髓损伤大鼠的受损部位并且消除速度较其他组明显缓慢，有效地延长了药物半衰期以及增强了脊髓受损部位的药物浓度，从而增强了治疗效果。

14、5、本发明建立sd大鼠的脊髓损伤模型，评价bmscs-tat-azm-nps@gel的体内药效学。采用basso-beattie-bresnahan(bbb)评分法，核磁共振成像技术，免疫组化，酶联免疫分析法(elisa)和格格里斯氏法(griess)，h&e染色，nissl染色，tunel染色等方法考察递药系统的体内治疗效果。bbb评分及体重指数结果表明，bmscs-tat-azm-nps@gel能改善sci大鼠后肢运动学功能；磁共振成像结果显示，bmscs-tat-azm-nps@gel组stir压脂序列和t1加权明暗信号分布均一，空洞面积明显减小，治疗效果优于其他组；bmscs-tat-azm_nps@gel组脊髓损伤大鼠给药后，脊髓组织中il-6、tnf-α、no、mpo和mda的浓度显著降低，sod酶的活力明显增强，表明bmscs-tat-azm-nps@gel可减轻大鼠脊髓损伤后的继发性损伤；h&e染色、nissl染色和tunel染色结果可以看出，治疗5w后bmscs-tat-azm-nps@gel组与其他组比较，病理特征明显减少，损伤的神经元和凋亡的神经细胞也显著降低，说明bmscs-tat-azm-nps@gel有明显的神经保护作用；体内安全性结果显示，bmscs-tat-azm-nps@gel显著降低原料药azm的肝毒性，其安全性较高。