兼具力学性能和促分化功能的水凝胶微球及其制备方法与应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种兼具力学性能和促分化功能的水凝胶微球及其制备方法与应用，能够用于内源性退变组织再生，尤其是对椎间盘退变组织的内源性再生。

背景技术：

1、干细胞在特殊诱导分化的调节下，具有向多种细胞增殖分化的潜能，从而有望弥补或代替退变细胞或组织的功能。然而，退变组织中异常的机械微环境诱发了细胞命运的错误定向，导致体外培养的干细胞在体内难以实现高效的内源性再生。

2、内源性再生策略一般是使用功能性生物材料激活组织内源性的祖/干细胞迁移到受损部位，内源性细胞通过分化来替代凋亡的细胞，同时分泌抗炎的细胞因子来实现组织重建。然而，在组织修复的过程中，即使生物材料成功募集到了足够的内源性细胞，也难以完全恢复正常的组织功能，往往导致内源性修复失败。

3、内源性修复失败的机制缘于损伤组织的恶劣微环境会影响内源性细胞的存活和分化，而未经训练的细胞缺乏向目标谱系定向分化和炎症调节的能力。因此，往往需要对内源性祖/干细胞进行合适地训练，以达到指导其分化为治疗性细胞来实现精准的内源性修复。

4、基于生物材料的细胞训练策略已经被应用于祖/干细胞的定向分化，这些训练策略主要可分为两类：生化诱导和物理刺激。生化诱导包括采用诱导性生化因子和基因工程方法。诱导性生化因子，例如bmp-2和tgf-β3能够促进干细胞的骨和软骨分化，然而这些诱导生化因子的使用剂量一直充满争议，为了保证干细胞的有效分化，通常需要添加高剂量的诱导生化因子，而高剂量的诱导生化因子在体内可能会激活炎症和额外的骨赘形成。基因工程方法，是通过调控特定的兴趣基因来精确训练干细胞行为，然而基因转染效率与细胞毒性之间很难取得平衡。物理刺激与生化诱导相比具有更高的生物安全性，诸如电磁刺激的物理信号训练已经被证实能在体外促进干细胞的神经和心脏分化，但是作为外源性的物理激励手段，不稳定的信号输入和能源供应问题限制了其在体内的应用。

5、细胞外基质(ecm)传递的机械信号被证明是调控干细胞行为和命运的巨大因素。细胞的整合素受体与ecm配体结合来实现稳定的粘附，细胞的肌动蛋白产生骨架来反馈ecm的机械信号，并通过yes相关蛋白(yap)将机械信号转录至核内，从而激活下游的信号通路调控自身的行为。在再生过程中，受损的组织会经历一系列的基质重塑和ecm模量的转变，以促进内源性干细胞的增殖和迁移、实现早期的自我修复。这一现象提示了ecm的弹性模量是训练干细胞行为模式的重要机械线索。

6、然而，在严重的组织损伤和长期的退行性疾病中，异常变化的基质模量会导致内源性干细胞池的耗竭和失控的分化，导致修复失败。例如，骨关节炎患者的软骨表现出远高于健康软骨的弹性模量；眼部组织的硬化与眼部神经退行性疾病的进程密切相关。

7、许多实验已经证明，模拟组织特异性模量的基质可以促进干细胞向特定的组织谱系分化。例如，tian等[1]的研究表明：软基质(<5kpa)抑制肌动蛋白丝形成，促进干细胞向脂肪和内皮细胞分化；而硬基质(>10kpa)促进干细胞的扩散及肌动蛋白聚合，从而激活yap的核定位，继而反映出更高的成骨、心肌的分化趋势。又如，engler[2]等发现，在较低弹性模量的水凝胶上(1kpa左右)，多能干细胞向神经细胞方向分化；在中等弹性模量的水凝胶上(10kpa左右)，由于与肌肉组织弹性模量相近，则细胞向肌细胞方向分化；在较高硬度的水凝胶上(100kpa左右)，则更适合成骨细胞方向分化。再如，李岳等[3]发现，材料本身的弹性模量增大，更利于肠道细胞的分化。可见，材料的弹性模量可显著影响细胞黏附、迁移、增殖和分化等行为，且不同组织的特异性模量与细胞分化密切相关。

8、椎间盘退变可归因于髓核(np)细胞的衰老和过度凋亡，导致细胞外基质(ecm)的合成/代谢失衡，最终导致ecm降解。研究证明从退化椎间盘中分离的髓核间充质干细胞具有较强的增殖能力和分化潜能。

9、近年来，多项研究证明在椎间盘的软骨终板、纤维环和髓核区域存在原生的祖/干细胞壁龛，并且这些细胞同样具备成骨、软骨和脂肪分化的全能性。因此，激活这些内源性细胞从壁龛区迁移到髓核是有望治疗椎间盘退变的新方法。

10、但是，由于退变椎间盘的髓核具有局部硬化的特征，较高的弹性模量将会传递不良的机械信号导致内源性细胞错误分化，加重椎间盘的纤维化和退变。因此，对于椎间盘而言，现有的具有机械训练的植入物往往会牺牲相应的弹性模量，以保证椎间盘源祖/干细胞向髓核细胞分化，但这对植入材料的使用性能造成了不利影响。由于椎间盘属于关节活动的应力组织，决定了椎间盘植入材料需要足够的力学性能和生物学要求，有些支架的模量和强度甚至达到了几十兆帕[4]。因此，人们一方面渴望椎间盘植入材料能够满足其较高的力学性能要求，另一方面又希望材料具有相对低的弹性模量以促进椎间盘源祖/干细胞向髓核细胞分化，成为现阶段椎间盘植入材料开发的一大矛盾。

11、例如，navaro等[5]合成了一种水凝胶，为了更有利于髓核干细胞的粘附并促进髓核相关基因aggrecan和sox9的表达，其研究结果表明选择具有较低剪切储能模量(1kpa)的水凝胶比具有较高剪切储能模量(2kpa)的水凝胶效果更佳。因此，现有研究得出的结论是：想要实现髓核干细胞更好的定向分化，促进相关分化基因的表达，更倾向于制备剪切储能模量为1kpa的水凝胶。显然，人们希望水凝胶材料的模量更高来满足其在体内的性能。

12、现阶段，对于如何解决椎间盘内源性干细胞在定向分化时需要较低的模量，但在体内应用时需要较高的强度的矛盾，极少有文献报道，该问题成为椎间盘植入材料研究的一大难题。

13、因此，在实现内源性治疗椎间盘再生过程中，如何提供一种既具有相对较高的弹性模量，能够更好满足椎间盘体内的应用，同时还能很好训练干细胞向髓核细胞分化的体内植入材料，成为亟待解决的技术问题。

14、引用的参考文献如下：

15、[1]k.-k.tian,s.-c.huang,x.-x.xia,z.-g.qian,biomacromolecules 2022,23,1777.

16、[2]engler a j,sen s,sweeney h l,et al.matrix elasticity directs stemcell lineage specification[j].cell,2006,126(4):677-89.

17、[3]李岳，浙江工商大学硕士论文，明胶/纳米纤维复合材料弹性模量对3d肠上皮细胞模型的影响及益生菌免疫功效的评估，公开日：2022.6.

18、[4]韩啸，中国医学科学院北京协和医学院博士论文，基于三周期极小曲面理念的聚氨酯多孔椎间盘支架设计与应力下性能评价，2022.4.

19、[5]y.navaro,n.bleich-kimelman,l.hazanov,i.mironi-harpaz,y.shachaf,s.garty,y.smith,g.pelled,d.gazit,d.seliktar,z.gazit,biomaterials 2015,49,68.

技术实现思路

1、本发明就是为了解决上述技术问题，从而提供一种兼具力学性能和促分化功能的水凝胶微球及其制备方法与应用。本发明的技术目的在于，提供一种水凝胶微球及制备方法，解决现有的水凝胶材料存在的在治疗椎间盘内源性再生时需要较低的模量才能更好促进髓核干细胞的分化，但在植入体内应用时又需要较高的力学强度来保证其使用性能之间的矛盾。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明首先提供了一种兼具力学性能和促分化功能的的水凝胶微球的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)使用明胶和甲基丙烯酸酐合成可光交联的明胶甲基丙烯酸酯(gelma)预聚物；

5、(2)通过微流控方法制备明胶甲基丙烯酸酯水凝胶微球；

6、(3)将纤连蛋白溶液与步骤(2)所得明胶甲基丙烯酸酯水凝胶微球在恒温水浴中振荡孵育，得到纤连蛋白修饰的明胶甲基丙烯酸酯水凝胶微球；

7、(4)将血小板源生长因子-bb结合到步骤(3)所得纤连蛋白修饰的明胶甲基丙烯酸酯水凝胶微球上，得到兼具力学性能和促分化功能的水凝胶微球。

8、明胶甲基丙烯酸酯(gelma)是一种光交联水凝胶，由甲基丙烯酸酐(ma)取代明胶的赖氨酸和羟基赖氨酸合成。gelma水凝胶的机械性能可以通过改变甲基丙烯酸酐的取代度和紫外线的曝光时间来调节。在本发明中，通过酸处理得到的a型明胶用于ma改性，因为相比于由碱处理得到的b型明胶，纤连蛋白对a型明胶的亲和力更高。

9、现有的研究表明(如上文中参考文献[5])，较低的模量更有利于髓核干细胞的粘附并促进髓核相关基因aggrecan和sox9的表达，然而模量过低会影响植入材料在体内的应用，现有方法无法很好解决低模量能促进分化而高模量使用效果更佳的矛盾。而本发明方法制备得到的水凝胶微球能够很好解决这一矛盾，其不仅提供了一种能够实现相同分化效果的水凝胶微球，同时还使得水凝胶微球的模量得到提高，能够更好地在体内进行应用。

10、本发明人将微流控和光聚合技术结合，构建了明胶甲基丙烯酸酯(gelma)微球作为机械训练平台，通过改变光基团的取代度和交联条件实现弹性模量的精准调节(从1kpa到30kpa变化)。进一步地，纤连蛋白(fn)作为额外的ecm配体，通过其天然的明胶/胶原结合域与gelma微球紧密锚定，以促进内源性细胞的粘附和机械转导。同时，借由fn的肝素结合域将血小板源生长因子-bb(pdgf-bb)结合到fn修饰的gelma(fn@gelma)中，以构建能募集内源性干细胞的微球。通过上述方法，本发明构建得到了弹性模量相对提升，且不影响分化效果的水凝胶微球，在椎间盘植入材料再生领域具有极大的应用前景。

11、本发明提供的水凝胶材料基于fn强大的生长因子结合能力使得微球能支持pdgf-bb缓释超过28天，在体外能促进髓核干细胞的增殖和迁移能力。在体内，机械训练微球可以形成一个临时的干细胞生态位，在大鼠针刺椎间盘退变模型中同样观察到了椎间盘祖/干细胞的成功招募和上调的ecm合成。

12、进一步的是，步骤(2)中所述微流控方法的步骤如下：将明胶甲基丙烯酸酯预聚物和光引发剂的混合溶液注入微流控通道，在油相的剪切下形成单分散的水凝胶液滴，而后使用365nm蓝光交联液滴，形成固化的水凝胶微球。

13、进一步的，所述明胶甲基丙烯酸酯水凝胶微球中明胶甲基丙烯酸酯预聚物的浓度为7.5wt％，明胶甲基丙烯酸酯材料中光基团甲基丙烯酸酯的取代度为20％。

14、进一步的，步骤(3)中所述纤连蛋白溶液的浓度为2μg/ml。

15、进一步的，步骤(3)中所述纤连蛋白与明胶甲基丙烯酸酯水凝胶微球的重量比为1:3。

16、进一步的，步骤(3)中是于37℃下振荡孵育1小时。

17、进一步的，步骤(4)中所述血小板源生长因子-bb和纤连蛋白修饰的明胶甲基丙烯酸酯水凝胶微球的质量比为1:200000～250000。

18、进一步的，步骤(4)中是将稀释后的血小板源生长因子-bb溶液与纤连蛋白修饰的明胶甲基丙烯酸酯水凝胶微球于4℃下振荡孵育12小时。

19、本发明的目的之二是提供一种如上所述方法制备得到的兼具力学性能和促分化的水凝胶微球，所述水凝胶微球的弹性模量为2kpa，所述水凝胶微球的平均粒径为80-200μm。

20、本发明的目的之三是提供如上所述方法制备得到的水凝胶微球在制备治疗椎间盘退变的植入材料中的应用。

21、进一步的，本发明还提供了如上所述方法制备得到的水凝胶微球在制备治疗椎间盘内源性再生的药物中的应用。

22、本发明的有益效果如下：

23、本发明构建了一种兼具力学性能和促分化功能的水凝胶微球，其结合了内源性细胞招募和指导细胞分化的特性，以修复椎间盘退变。本发明提供的水凝胶微球能够独立且灵活地调节弹性模量和ecm配体密度，并能动员内源性干细胞的迁移并训练细胞、指导其分化命运。体外和体内实验表明，本发明的水凝胶微球能有效地通过机械信号传导来训练干细胞分化成髓核样细胞，实现最大的髓核修复能力。同时，该水凝胶材料的弹性模量与现有技术相比得到了提升，能够更好地用于体内应用。