一种载药纳米分子探针及其制备方法、应用与流程

本发明涉及生物医药，尤其涉及一种载药纳米分子探针及其制备方法、应用。

背景技术：

1、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,aml)是多能干细胞或已轻度分化的前体细胞核型发生突变所形成的一类疾病，是造血系统的克隆性恶性疾病。aml是较为常见的一种成人血液恶性肿瘤，发病率随着年龄的增长而增加，且aml患者完全治愈率低，总体预后较差。

2、近十年来，优化传统化疗方案可使aml患者完全缓解率(cr)达到92.0％，3年总生存率(os)达到58.7％，3年无病生存期(dfs)达到63.4％。尽管优化的传统化疗方案提升了aml患者的疗效，但其伴随的不良反应发生率并没有相应的降低，长期安全性较差。当前新兴的免疫疗法，特别是针对aml免疫检查点的阻断剂，通过阻断影响肿瘤生长侵袭的免疫检查点，激活患者本身抗白血病免疫力，从而适度减少患者对强化疗的依赖，降低药物的副作用。然而，现有的免疫疗法在对阻断剂的药物递送效率偏低，影响免疫疗法的有效性。而且肿瘤存在异质性，患者服药后存在个体免疫反应差异，临床上仍缺乏简便，无创伤的可跟踪患者采用免疫疗法后其疗效的实时监测技术。

3、因此，现有技术还有待于进一步的改进和提升。

技术实现思路

1、鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种载药纳米分子探针，能够提高药物递送效率，同时监测其疗效，提高免疫疗法的有效性。

2、为了实现上述目的，本发明的一方面提供一种载药纳米分子探针，其中，包括：用聚乙二醇(polyethyleneglycol,peg)修饰的聚多巴胺(polydopamine,pda)纳米粒子和与所述经纳米粒子表面peg化学键偶联的负载药物；所述peg带有氨基和/或羧基。

3、通过采用pda纳米粒子做为药物载体，对细胞毒性极小，可以减少由于药物引起的副作用。

4、可选地，所述的载药纳米分子探针，其中，所述载药纳米分子探针还包括：用颗粒酶b识别肽修饰的石墨烯量子点(graphene quantum dots,gqd)，所述gqd附着在所述pda纳米粒子的表面。

5、通过在载药纳米分子探针中复合用颗粒酶b识别肽修饰的gqd，单一给药，可实现多个不同的功能，除靶向递送抗肿瘤药物外，还可实时监测治疗效果。实现监测的原理为：基于pda纳米粒子的光吸收特性及gqd的近红外发射光特性。当gqd由于物理吸附到pda纳米粒子上后，由于荧光能量共振转移原理，gqd探针的近红外发射光无法检测到，只有在t淋巴细胞介导的免疫反应发生，产生颗粒酶b，通过识别并剪切gqd探针上的多肽，使gqd探针从pda上脱落，游离的gqd产生的近红外光即可被检测到。

6、可选地，所述的载药纳米分子探针，其中，所述负载药物选自抗人lilrb4单抗。

7、需要说明的是，抗人lilrb4单抗：抗人类白细胞免疫球蛋白受体b4单克隆抗体(anti-human leukocyte immunoglobulin-like receptor b4monoclonal antibody)，也称为cd85κ单抗或ilt3单抗。

8、cd85κ单抗：抗cd85k单克隆抗体(anti-cd85k monoclonal antibody)，cd85k也称为ilt2，是一种免疫球蛋白样受体，与免疫调节有关。

9、ilt3单抗：抗ilt3单克隆抗体(anti-immunoglobulin-like transcript3monoclonal antibody)，ilt3是一种免疫球蛋白样受体，在抗病毒免疫反应中发挥重要作用。

10、pd-l1：程序性死亡配体1(programmed death-ligand 1)，也称为b7-h1，是一种免疫检查点分子，可以通过与pd-1受体结合来抑制免疫反应。

11、pd-l2：程序性死亡配体2(programmed death-ligand 2)，也称为b7-dc，是一种免疫检查点分子，可以通过与pd-1受体结合来抑制免疫反应。

12、pd-1：程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1)，也称为cd279，是一种免疫检查点受体，与pd-l1和pd-l2结合后可以抑制t细胞的活化。

13、ctla-4：细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic tlymphocyte-associatedantigen 4)，也称为cd152，是一种免疫检查点受体，可以通过竞争性结合b7分子来抑制t细胞的活化。

14、可选地，所述的载药纳米分子探针，其中，所述颗粒酶b识别肽，其中，所述颗粒酶b为负载药物激活机体的细胞毒性t细胞后的免疫效应分子。gqd具有近红外发射光，可替代荧光染料作为探针。荧光染料包括但不限于：异硫氰酸荧光素(fitc)，四乙基罗丹明(rb2000)，四甲基异硫氰酸罗丹明(tritc)，藻红蛋白(pe),镧系螯合物eu/tb等，偶联识别颗粒酶b多肽序列。本发明更优选有机纳米材料gqd，替代传统荧光染料，避免荧光染料产生的毒性作用。且gqd的近红外光特性，此波长光谱范围内背景荧光较低，且在这个区域ccd相机/检测器检测灵敏度最高。因此，可通过活体成像实现实时监测aml患者的治疗效果。

15、本发明的另一方面，提供一种上述所述的载药纳米分子探针的制备方法，其中，包括：

16、将peg分散在pda纳米粒子分散液中，进行搅拌处理，得到中间体；所述peg带有氨基和/或羧基；

17、分别将所述中间体、负载药物分散在含有n-(3-二甲氨基丙基)-n’-乙基碳化二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的溶液中，在预设反应条件下反应，得到载药纳米分子探针。

18、可选地，所述的载药纳米分子探针的制备方法，其中，所述含有edc和nhs的溶液中，所述edc/nhs的摩尔比为2:1。

19、可选地，所述的载药纳米分子探针的制备方法，其中，所述分别将所述中间体、负载药物分散在含有edc和nhs的溶液中，在预设反应条件下反应，得到载药纳米分子探针的步骤之后还包括：

20、将gqd与edc溶液相混合，得到gqd分散液；

21、将具有游离氨基的颗粒酶b识别肽加入到所述gqd分散液中反应后，进行离心处理，得到用颗粒酶b识别肽修饰的gqd；

22、将所述用颗粒酶b识别肽修饰的gqd与所述载药纳米分子探针混合，避光搅拌过夜，得到具有监测功能的载药纳米分子探针。

23、可选地，所述的载药纳米分子探针的制备方法，其中，所述gqd与edc/nhs的摩尔比为1:3000。

24、可选地，所述的载药纳米分子探针的制备方法，其中，所述预设反应条件为4℃条件下搅拌12小时。

25、本发明的另一方面，还提供一种上述所述的载药纳米分子探针在制备aml药物中的应用。

26、有益效果：与现有技术相比，本发明的载药纳米分子探针具有高效负载免疫治疗药物的优势，经过实验验证，本发明采用pda纳米粒子进行载药，只需粒子负载四分之一的lilrb4单抗量，通过人源性aml造模小鼠给药(相当于2.5mg/kg lilrb4单抗)，即可达到相等水平的抗肿瘤效果(每次人源性aml小鼠给药需达10mg/kg的剂量，才可观察到明显的抗肿瘤效果)。pda纳米粒子，此材料来源于人体黑色素组成成分多巴胺，对细胞毒性极小；采用其负载药物进行aml造模治疗，可减少药物的使用剂量，减少由于药物引起的副作用。