本发明涉及生物医用材料领域，尤其涉及一种脂肪脱细胞生物材料及其制备方法。
背景技术：
1、自体组织移植通常被认为是组织修复金标准，但自体取材量受限，以及会对患者造成二次伤害使得自体组织移植具有一定的局限性。可用于组织修复的最佳支架是目标组织的细胞外基质。目前为止已商品化的同种异体细胞外基质产品主要是真皮、肌腱、神经以及骨组织。相对于异种来源材料，人体组织的获取非常宝贵，通常来自于遗体捐赠项目。
2、而在吸脂手术中，大量的脂肪组织常作为医疗废物被丢弃。研究表明，从脂肪中提取的脂肪脱细胞基质用于体外脂肪组织工程和体内脂肪组织再生，且不局限于脂肪组织工程，还具有愈合伤口、再生骨、支持乳腺组织重建和促进神经修复的潜在应用。
3、虽然该领域的研究取得了许多进展，但仍有许多问题亟待解决和深入研究。
4、商业化的脱细胞产品对病毒灭活和免疫原性的清除要求很高，然而目前的工艺从脂肪组织中去除细胞物质和脂肪、清除病毒和其他免疫原性物质的复杂工艺在脱细胞的同时，也会清除活性蛋白因子，大大降低了脂肪脱细胞产品自有的生物活性，从而影响了材料引导组织修复和再生的能力。
5、为此有必要提供一种新的脂肪脱细胞生物材料及其制备方法，以解决现有技术的不足。
技术实现思路
1、本发明的目的就是提供一种脂肪脱细胞生物材料及其制备方法，特别是提供一种具有组织修复和引导组织再生的能力的生物材料及其制备方法，可用于软组织缺损修复、整形填充等领域。
2、在本发明的第一方面，提供了一种脂肪脱细胞生物材料，所述脂肪脱细胞生物材料由以下方法制备，所述方法包括以下步骤：
3、(1)提供一脂肪组织原料，将所述脂肪组织原料破碎，并进行漂洗，从而获得经漂洗的脂肪组织；
4、(2)对所述经漂洗后的脂肪组织进行离心，获得分层的混合物，去除上层油层和下层水层，收集中间层；
5、(3)对所述中间层进行乳化，获得乳化的脂肪混合物；
6、(4)将所述乳化的脂肪混合物通过离心处理，从而获得中间液体层，即为脂肪初提物a；获得中间固体层，即为脂肪初提物b；
7、(5)对所述脂肪初提物a进行过滤和除菌，从而获得无细胞的脂肪提取物c；
8、(6)对脂肪初提物b依次进行乳化处理、消毒处理、脱细胞处理和脱脂处理，从而获得无细胞脂肪提取物d；
9、(7)将无细胞的脂肪提取物c与d混合，后处理获得所述脂肪脱细胞生物材料。
10、在另一优选例中，所述经过后处理的脂肪脱细胞生物材料为固体材料。
11、在另一优选例中，所述经过后处理的脂肪脱细胞生物材料为块状材料。
12、在另一优选例中，所述脂肪脱细胞生物材料为多孔材料。
13、在另一优选例中，所述脂肪脱细胞生物材料的孔径为1-1000μm。
14、在另一优选例中，所述脂肪脱细胞生物材料不含有细胞且不含有脂滴。
15、在另一优选例中，所述脂滴为脂肪细胞破碎后释放的油滴。
16、在另一优选例中，所述“不含有脂滴”指所述脂肪脱细胞生物材料中，油滴体积占总液体百分比小于1％，优选地小于0.5％，更优选地小于0.1％。
17、在另一优选例中，所述细胞选自下组：内皮细胞、脂肪干细胞、巨噬血细胞、基质细胞。
18、在另一优选例中，所述“不含有细胞”指1ml脂肪脱细胞生物材料中的细胞平均数量≤1个，优选地≤0.5个，更佳地≤0.1个，或为0个。
19、在另一优选例中，所述的步骤(1)中，使用生理盐水进行漂洗。
20、在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述离心在800-2500g下离心，较佳地800-2000g，更佳地1000-1500g，最佳地1100-1300g。
21、在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述离心的时间为1-15min，较佳地1-10min，更佳地1-8min，最佳地1-5min。
22、在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述中间层为包含脂肪细胞的脂肪层。
23、在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述分层的混合物分为3层，上层为油层，中间层为包含脂肪细胞的脂肪层，下层为水层。
24、在另一优选例中，所述的步骤(3)中，所述的乳化为机械乳化。
25、在另一优选例中，所述机械乳化为经注射器反复吹打(如吹打20-200次，较佳地20-150次，更佳地20-100次，更佳地30-50次)进行机械乳化。
26、在另一优选例中，所述的吹打的方式为2个10ml注射针筒连接三通管反复匀速推打。
27、在另一优选例中，所述的步骤(3)中，所述乳化包括通过组织匀浆机进行打碎乳化。
28、在另一优选例中，所述的步骤(4)中，在将所述乳化的脂肪混合物通过离心处理前，还包括对所述乳化的脂肪混合物冷冻后解冻处理。
29、在另一优选例中，待冷冻后解冻处理后，将解冻后的混合物用于离心。
30、在另一优选例中，所述的冷冻的温度为-50℃至-120℃，较佳地-60℃至-100℃，更佳地-70℃至-90℃。
31、在另一优选例中，所述的解冻的温度为20-40℃，较佳地25-40℃，更佳地37℃。
32、在另一优选例中，所述的冷冻后解冻的循环次数为1-5次(优选为1、2、3或4次)。
33、在另一优选例中，所述的步骤(4)中，离心后，所述乳化的脂肪混合物分层4层，第一层为油层，第二层为残余脂肪组织层，第三层为液体层，第四层为细胞/组织碎片沉淀层。
34、在另一优选例中，所述步骤(4)中的中间固体层为第二层，即残余脂肪组织层。
35、在另一优选例中，所述步骤(4)中的中间液体层为第三层，即液体层。
36、在另一优选例中，所述的步骤(4)中，所述离心在800-2500g下离心，较佳地800-2000g，更佳地1000-1500g，最佳地1100-1300g。
37、在另一优选例中，所述的步骤(4)中，所述离心的时间为1-15min，较佳地1-10min，更佳地2-8min，最佳地3-7min。
38、在另一优选例中，所述的步骤(4)中，第一层、第二层、第三层和第四层从上到下依次排列。
39、在另一优选例中，所述的步骤(4)中，所述的中间液体层为透明或基本透明层。
40、在另一优选例中，所述的步骤(4)中，所述的中间固体层为黄色或棕色。
41、在另一优选例中，所述的步骤(5)中，所述的过滤将脂肪初提物a中的脂肪细胞或者其他可能混有的活细胞除去。
42、在另一优选例中，所述的步骤(5)中，所述的过滤和除菌使用过滤器进行。
43、在另一优选例中，所述的过滤器为微孔滤膜过滤器。
44、在另一优选例中，所述的微孔滤膜过滤器的孔径大小为0.05-0.8μm，较佳地0.1-0.5μm，更佳地0.1-0.4μm，更佳地0.15-0.3μm，更佳地0.2-0.25μm，最佳地0.22μm。
45、在另一优选例中，所述的步骤(5)中，所述的过滤和除菌包括先通过可滤去细胞的第一过滤器，然后再通过可滤去病原体(如细菌)的第二滤器(如0.22μm的滤器)进行。
46、在另一优选例中，所述的步骤(5)中，还包括对所述脂肪提取物c进行分装，形成分装后的混合物。
47、在另一优选例中，所述分装后的提取物进行冷冻保存或低温保存。
48、在另一优选例中，所述分装后的提取物于-20℃冷冻保存待用，优选地，所述分装后的提取物在冷冻保存后于低温(如-4℃)或常温解冻后直接使用，或解冻后置于低温(如4℃)保存一段时间然后使用。
49、在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述乳化处理包括机械乳化。
50、在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述乳化处理包括用匀浆机进行匀浆乳化。
51、在另一优选例中，所述匀浆机的转速为5000-15000r/min，优选8000-15000r/min，例如10000r/min、12000r/min。
52、在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述乳化的时间为0.5-15min，较佳地1-10min，更佳地1-8min，最佳地1-5min。
53、在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述乳化处理还包括离心分离油层的步骤。
54、在另一优选例中，所述离心在1000-8000r/min下离心，较佳地2000-5000r/min，更佳地4000r/min。
55、在另一优选例中，所述离心的时间为2-20min，较佳地5-15min，更佳地10min。
56、在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述消毒处理包括与消毒剂混合消毒的步骤。
57、在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述消毒处理包括与消毒剂混合，振荡处理后弃去液体层。
58、在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述消毒处理包括辐照消毒，振荡处理后弃去液体层。
59、在另一优选例中，所述消毒剂为过氧乙酸和乙醇的混合溶液、超临界二氧化碳。
60、在另一优选例中，所述过氧乙酸的浓度为0.05-3％，优选0.1-2％，更优选0.1-1％，例如0.5％。
61、在另一优选例中，所述乙醇的浓度为1-24％，优选2-20％，更优选2-10％，例如4％、5％、8％。
62、在另一优选例中，乳化处理后得到的固体内容物与所述消毒剂的质量比为1:1～1:20，优选1:2～1:20，更优选1:5～1:20，例如1:8、1:10。
63、在另一优选例中，所述振荡处理的时间为0.5-6h，优选1-6h，例如4h。
64、在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述脱细胞处理包括与脱细胞剂混合的步骤。
65、在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述脱细胞处理包括与脱细胞剂混合，振荡处理后弃去液体层。
66、在另一优选例中，所述脱细胞剂选自sds、tritonx-100、脱氧胆酸钠，或其组合。
67、在另一优选例中，所述脱细胞剂的浓度为0.2-5％，优选0.5-2％，更优选0.8-1.5％，例如1％。
68、在另一优选例中，消毒处理后得到的固体内容物与所述脱细胞剂的质量比为1:1～1:20，优选1:2～1:20，更优选1:5～1:20，例如1:8、1:10。
69、在另一优选例中，所述振荡处理的时间为12-96h，例如12h、24h、48h、72h。
70、在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述脱脂处理包括与脱脂剂混合的步骤。
71、在另一优选例中，所述的步骤(6)中，所述脱脂处理包括与脱脂剂混合，振荡处理后弃去液体层。
72、在另一优选例中，所述脱脂剂选自异丙醇、乙醇、乙醚，或其组合。
73、在另一优选例中，脱细胞处理后得到的固体内容物与所述脱脂剂的质量比为1:1～1:20，优选1:2～1:20，更优选1:5～1:20，例如1:6、1:8、1:10。
74、在另一优选例中，所述振荡处理的时间为0.5-8h，优选2-8h，例如3h、4h。
75、在另一优选例中，所述乳化处理、消毒处理、脱细胞处理和脱脂处理中，任选地还包括清洗的后处理步骤。
76、在另一优选例中，所述清洗包括依次进行pbs溶液清洗，纯化水清洗。
77、在另一优选例中，所述的步骤(7)包括以下步骤：
78、(7a)将步骤(6)得到的脂肪提取物d与水混合，搅拌，得到乳液；
79、(7b)将脂肪提取物c加入到步骤(a)得到的乳液中，混合；
80、(7c)冷冻干燥后得到所述脂肪脱细胞生物材料。
81、在另一优选例中，所述步骤(7a)中，所述脂肪提取物d与水的质量比为1:5～1:50，优选1:10～1:50，更优选1:10～1:30，例如1:20。
82、在另一优选例中，所述步骤(7c)中，还包括先注入模具，再冷冻干燥的步骤。
83、在另一优选例中，所述步骤(7c)中，所述冷冻干燥包括先预冻，再冷冻干燥的步骤。
84、在另一优选例中，所述步骤(7c)中，所述冷冻干燥包括先-50～-150℃下预冻12-24h，再冷冻干燥24-48h的步骤。
85、在本发明的第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的脂肪脱细胞生物材料的制备方法，所述方法包括以下步骤：
86、(1)提供一脂肪组织原料，将所述脂肪组织原料破碎，并进行漂洗，从而获得经漂洗的脂肪组织；
87、(2)对所述经漂洗后的脂肪组织进行离心，获得分层的混合物，去除上层油层和下层水层，收集中间层；
88、(3)对所述中间层进行乳化，获得乳化的脂肪混合物；
89、(4)将所述乳化的脂肪混合物通过离心处理，从而获得中间液体层，即为脂肪初提物a；获得中间固体层，即为脂肪初提物b；
90、(5)对所述脂肪初提物a进行过滤和除菌，从而获得无细胞的脂肪提取物c；
91、(6)对脂肪初提物b依次进行乳化处理、消毒处理、脱细胞处理和脱脂处理，从而获得无细胞脂肪提取物d；
92、(7)将无细胞的脂肪提取物c与d混合，后处理获得所述脂肪脱细胞生物材料。
93、在另一优选例中，所述方法如本发明第一方面所述。
94、在本发明的第三方面，提供了一种医用材料，所述医用材料包括：如本发明第一方面所述的脂肪脱细胞生物材料，和药学上可接受的载体。
95、在本发明的第四方面，提供了一种医疗美容材料，所述医疗美容材料包括：如本发明第一方面所述的脂肪脱细胞生物材料，和医疗美容领域中可接受的载体。
96、在本发明的第五方面，提供了一种组织修复材料，所述组织修复材料包括如本发明第一方面所述的脂肪脱细胞生物材料。
97、在另一优选例中，所述组织修复材料是可注射组织修复材料。
98、在另一优选例中，所述组织修复材料还包括可接受的载体。
99、在另一优选例中，所述组织修复材料还包括流动剂，选自下组：生理盐水、pbs缓冲液、甘油、聚乙二醇，或其组合。
100、在另一优选例中，所述组织修复材料通过注射填充，或者手术开口直接填充的方式施用于需要组织修复的部位。
101、在本发明的第六方面，提供了如本发明第一方面所述的脂肪脱细胞生物材料的用途，用于制备一医用材料或医疗美容材料，所述医用材料用于软组织修复，所述医疗美容材料用于整形填充。
102、在本发明的第七方面，提供了一种软组织修复的方法，所述方法包括将如本发明第一方面所述的脂肪脱细胞生物材料施用于有此需要的对象。
103、在本发明的第八方面，提供了一种整形填充的方法，所述方法包括将如本发明第一方面所述的脂肪脱细胞生物材料施用于有此需要的对象。
104、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。