芦丁及雷帕霉素在制备协同化疗剂抑制肿瘤的药物中的应用

本发明属于药学领域，更具体地，本发明涉及芦丁及雷帕霉素在制备协同化疗剂抑制肿瘤的药物中的应用。

背景技术：

1、细胞衰老是指真核细胞一种相对稳定且通常不可逆的细胞周期停滞的状态，在这种状态下增殖细胞会对促生长刺激产生耐受，通常由dna损伤等胁迫性信号所引起。衰老细胞中炎症性细胞因子的表达水平显著升高，这一现象被称为衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，sasp)。衰老细胞能通过分泌胞外基质蛋白、炎症相关因子及癌细胞生长因子促进邻近癌前细胞发生癌变或恶性程度上升，这些蛋白被称为sasp因子。

2、衰老细胞主要通过3个途径参与机体的各种生理和病理过程：(1)衰老细胞基因表达和形态改变逐步累积可影响相应组织的功能；(2)衰老细胞限制干细胞和未分化祖细胞的再生潜能，导致细胞再生能力下降；(3)衰老细胞不仅表现为生长周期停滞，还通过自分泌和旁分泌途径释放大量的细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶等，影响邻近细胞和组织的微环境，导致和加速衰老及相关疾病。

3、dna损伤、端粒功能障碍、癌基因激活、氧化应激等刺激均可诱导细胞出现sasp，其机制与转录级联、自分泌环路和持续dna损伤反应密切相关。但是，过表达或者抑制衰老经典通路p53和p16ink4a/rb不能影响sasp的表达，表明尽管衰老细胞的周期停滞和sasp经常协同发生，两者的调控通路并不完全重叠。据报道，dna损伤反应通过激活毛细血管扩张共济失调突变基因、奈梅亨断裂综合征蛋白1和检测点激酶2增加sasp因子il-6和il-8的分泌。dna损伤反应(ddr)在细胞受损后立即被激活，衰老细胞出现成熟sasp则需要约1周甚至更长的时间，并且短暂的dna损伤反应并不能诱导细胞衰老，也不能诱导sasp，表明除了dna损伤反应外还存在其它机制共同诱导sasp。

4、研究表明，ddr、p38mapk和mtor信号作为上游驱动因子，nf-κb和c/ebpβ作为下游转录因子，均参与到衰老细胞sasp的调节过程中。nf-κb和c/ebpβ转录因子在细胞衰老时活性增加，参与调节细胞应激和炎症信号的细胞因子表达。细胞衰老时磷酸化的nf-κb/rela亚基入核，与sasp启动基因结合，调控sasp因子表达，因此nf-κb通常被称为sasp的主调节器。小鼠肝脏、肾脏及老年人大脑组织的衰老细胞中锌指转录因子4(gata4)水平较高，gata4可以通过调节衰老细胞中nf-κb的活性影响sasp相关基因il-6、il-8、cxcl1的表达。p38mapk是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员之一，是重要的信号转导分子，激活或者阻断p38mapk足以影响衰老细胞sasp形成。p38mapk在衰老程序开始几天后被激活，通过活化丝裂原和应激激活的蛋白激酶-msk1和msk2，间接激活nf-κb，使得p65和p50在核内聚集，这与sasp早期发展过程相一致。衰老细胞不直接分泌促炎因子il-1α，但衰老细胞表面分布大量的il-1α，与nf-κb共同形成正前馈环路促进炎性因子的编码转录，建立和维持sasp。mtor通过调节il-1α水平促进sasp因子分泌，而雷帕霉素不影响il-1αmrna水平，却明显降低衰老细胞表面il-1α蛋白的表达。mtor也能够调节p38mapk下游信号mapkapk2影响sasp因子分泌，细胞衰老期间，mapkapk2磷酸化rna结合蛋白zfp36l1，从而限制其对sasp因子转录产物的降解能力。转录因子c/ebpβ与肿瘤基因激活诱导的细胞衰老有关，衰老时c/ebpβ募集到il-6启动子上，直接促进sasp因子转录，c/ebpβ也是il-6正前馈自分泌环路的重要组成部分，可以激活sasp的炎症网络，是sasp早期扩散的重要调节器。hmgb2靶向作用于c/ebpβ调控sasp，通过抑制异染色质的扩散来促进sasp基因的表达，细胞衰老期间大量hmgb2与染色质结合，消除了衰老相关异染色质位点(sahf)对sasp基因的沉默作用，导致il-8、il-6等表达增加。

5、表观遗传改变通过影响dna损伤修复、端粒长度和代谢途径或激活衰老相关基因和mirnas的表达而影响衰老。多种证据表明染色质状态的改变与细胞衰老的控制密切相关。细胞可以感觉到不同的衰老刺激，这些刺激会激活信号通路，驱动染色质状态的改变。然而，衰老信号引起这种改变的途径仍然很大程度上是未知的。因此，从表观遗传角度揭示细胞衰老及其特定表型发生发展的调控机制，从进而揭示具有靶向价值的关键分子及其信号通路，是将来衰老生物学和老年医学的一个新兴方向，亟需深入开展相关探索，为临床医学提供重要科学依据和潜在的干预措施。

6、尽管越来越多的实验支持靶向细胞衰老可以同时治疗多种衰老相关疾病如肿瘤，但还有待严谨的人体临床试验以帮助人们更好地评估延缓衰老药物的益处和风险。尽管国际已知的多种sasp抑制剂均可显著减弱sasp，但本质上不会杀死衰老细胞。为了在药理学上减轻衰老细胞的负担，科学家们正在开发“senolytics”(衰老细胞清除药物)这种性质的小分子、多肽和抗体来选择性地清除衰老细胞。

7、除了“senolytics”药物，本领域还关注“senomorphics”药物。“senolytics”主要是通过消除衰老的细胞来发挥功效，而“senomorphics”的功能实现则是通过调节衰老细胞的生物特性而非消除它们。

8、综上，本领域还需要挖掘更多的影响sasp的药物，以期为细胞衰老以及肿瘤的防治提供更多的途径。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供芦丁及雷帕霉素在制备协同化疗剂抑制肿瘤的药物中的应用。

2、在本发明的第一方面，提供芦丁及雷帕霉素或它们的衍生物的应用，用于与化疗药物联合使用，制备特异性靶向抑制衰老相关分泌表型(sasp)及抑制肿瘤和/或逆转肿瘤耐药性的组合物；其中，所述的化疗药物为给药后诱发衰老相关分泌表型的化疗药物，包括米托蒽醌或博莱霉素；所述衍生物包括芦丁及雷帕霉素的药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药。

3、在一种或多种实施方式中，所述抑制肿瘤包括抑制肿瘤本身，以及抑制肿瘤的迁移和侵袭。

4、在一种或多种实施方式中，所述衰老相关分泌表型为dna损伤导致的衰老相关分泌表型。

5、在一种或多种实施方式中，所述的dna损伤为化疗药物造成的dna损伤。

6、在一种或多种实施方式中，所述组合物中，所述芦丁或雷帕霉素或它们的衍生物还用于：抑制广谱衰老相关分泌表型的表达；较佳地，其在不影响细胞衰老的情况下抑制广谱衰老相关分泌表型的表达；干扰atm与hif1α和traf6的相互作用，抑制急性应激相关表型(asap)；消除衰老基质细胞以旁分泌的方式赋予癌细胞的恶性；增加肿瘤细胞凋亡率；和/或，抑制衰老相关分泌表型的组分il8、il6、il1a、il1b、cxcl3、mmp3、gm-csf。

7、在一种或多种实施方式中，所述的肿瘤包括：前列腺癌，乳腺癌，肺癌，结直肠癌，胃癌，肝癌，胰腺癌，膀胱癌，皮肤癌，肾癌，食管癌、胆管癌、脑癌。

8、在一种或多种实施方式中，所述的化疗药物为米托蒽醌；所述组合物中(或联合使用时)，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:20～80:20～80；较佳地，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:30～70:30～70；更佳地，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:40～60(如1:45:45，1:50:50，1:55:55等比例)。

9、在本发明的另一方面，提供一种用于特异性靶向抑制衰老相关分泌表型以及抑制肿瘤和/或逆转肿瘤耐药性的药物组合物或药盒，包括：芦丁及雷帕霉素或它们的衍生物，以及化疗药物；其中，所述的化疗药物为给药后诱发衰老相关分泌表型的化疗药物，包括米托蒽醌或博莱霉素；所述衍生物包括芦丁及雷帕霉素的药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药。

10、在一种或多种实施方式中，米托蒽醌与芦丁及雷帕霉素组合时，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:20～80:20～80；较佳地，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:30～70:30～70；更佳地，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:40～60(如1:45:45，1:50:50，1:55:55等比例)。

11、在本发明的另一方面，提供一种制备抑制肿瘤和/或逆转肿瘤耐药性的药物组合物或药盒的方法，包括：将芦丁及雷帕霉素或它们的衍生物与化疗药物混合；或将芦丁及雷帕霉素或它们的衍生物与化疗药物置于同一药盒中；其中，所述的化疗药物为给药后诱发衰老相关分泌表型的化疗药物，包括米托蒽醌或博莱霉素；较佳地，将米托蒽醌与芦丁及雷帕霉素混合或组合时，米米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:20～80:20～80；较佳地，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:30～70:30～70；更佳地，米托蒽醌、芦丁、雷帕霉素的重量比例为1:40～60(如1:45:45，1:50:50，1:55:55等比例)；所述衍生物包括芦丁及雷帕霉素的药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药。

12、在一种或多种实施方式中，将芦丁及雷帕霉素或它们的衍生物与化疗药物混合，根据用药疗程分为单位剂型。

13、在本发明的另一方面，提供芦丁及雷帕霉素或它们的衍生物的用途，用于制备特异性靶向抑制衰老相关分泌表型的组合物；较佳地，所述芦丁及雷帕霉素或它们的衍生物干扰atm与hif1α和traf6的相互作用，抑制急性应激相关表型；消除衰老基质细胞以旁分泌的方式赋予癌细胞的恶性；和/或，增加肿瘤细胞凋亡率；所述衍生物包括芦丁及雷帕霉素的药学上可接受的盐、酯、异构体、溶剂合物或前药。

14、在本发明的另一方面，提供一种筛选促进芦丁及雷帕霉素(或它们的衍生物)靶向抑制衰老相关分泌表型及抑制肿瘤和/或逆转肿瘤耐药性的潜在物质的方法，所述方法包括：

15、(1)提供一肿瘤微环境体系，该体系包括肿瘤细胞(较佳地还可包括基质细胞)；

16、(2)利用化疗药物处理(1)的体系，诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型；其中，所述的化疗药物为给药后诱发衰老相关分泌表型(sasp)的化疗药物，包括米托蒽醌或博莱霉素；在诱发肿瘤微环境发生衰老相关分泌表型之前、之时或之后，以芦丁及雷帕霉素进行处理；和

17、(3)将候选物质加入到(2)的体系中，观测其对肿瘤微环境体系的作用，若所述候选物质在统计学上能够促进(显著促进，如促进10％、20％、30％、50％以上或更高)芦丁及雷帕霉素抑制衰老相关分泌表型及抑制肿瘤和/或逆转肿瘤耐药性，则该候选物质是可与芦丁及雷帕霉素联用、抑制肿瘤的潜在物质。

18、在一种或多种实施方式中，通过观测caspase 3cleavage活性或sasp因子的表达来评估细胞凋亡情况或衰老相关分泌表型的情况。较佳地，所述sasp因子包括但不限于：il6、il8、il1a、il1b、cxcl3、mmp3、gm-csf。

19、在一种或多种实施方式中，通过观测atm与hif1α和traf6的相互作用(抑制急性应激相关表型)来评估，若芦丁及雷帕霉素干扰atm与hif1α和traf6的相互作用的能力(抑制急性应激相关表型)被促进(显著促进，如促进10％、20％、30％、50％以上或更高)，则该候选物质是可与芦丁及雷帕霉素联用、抑制肿瘤的潜在物质。

20、在一种或多种实施方式中，通过观测衰老基质细胞以旁分泌的方式赋予癌细胞的恶性的情况来评估，若候选物质产生衰老基质细胞并使其以旁分泌的方式赋予癌细胞的恶性的能力，则该候选物质是可与芦丁及雷帕霉素联用、抑制肿瘤的潜在物质。

21、在本发明的另一方面，提供一种筛选抑制衰老相关分泌表型的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)提供一基质细胞体系，诱导该体系产生衰老相关分泌表型；在衰老相关分泌表型之前、之时或之后，以芦丁及雷帕霉素进行处理；(2)将候选物质加入到(1)的体系中，观测其对该基质细胞体系的作用，若其能特异性促进芦丁及雷帕霉素对于衰老相关分泌表型的抑制作用，则该候选物质是可与芦丁及雷帕霉素联用、抑制衰老相关分泌表型的潜在物质。

22、在一种或多种实施方式中，还包括设置对照组，从而明确分辨测试组中肿瘤微环境体系与对照组的差异，或芦丁靶向抑制衰老相关分泌表型及抑制肿瘤和/或逆转肿瘤耐药性与对照组的差异。

23、在一种或多种实施方式中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对性设计的或存在于广谱化合物库/生物分子库中的小分子化合物，混合物(如植物提取物)，生物大分子、信号通路调控试剂等。

24、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。