粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖在制备用于改善皮肤状况产品中的应用

本发明涉及微生物，具体涉及粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖在制备用于改善皮肤状况产品中的应用。

背景技术：

1、皮肤作为人体最大的器官，是内部器官与外界环境的第一道保护屏障，是人体抵御物理、化学、生物等各种外部致病因素的第一线防线。随着生活水平的不断提高，人们对皮肤的干燥、衰老等造成的皮肤问题越发重视，常使用相关功效护肤品或药物进行皮肤护理。

2、人体皮肤微生态是有细菌、真菌、病毒和螨虫等各种微生物与皮肤组织、细胞各种分泌物等共同组成的生态系统。皮肤常驻菌群参与皮肤皮脂代谢，维持皮肤表面酸碱度，分解角质，为皮肤抵抗外界病原体入侵起到了生物屏障作用，皮肤益生菌的代谢产物对宿主有直接或间接的保护作用，能够改善皮肤表面有益菌株的多样性，改善皮肤状况。

3、通过从健康人皮肤中筛选得到的皮肤共生菌菌株及其分泌物胞外多糖，具有广阔的应用前景。

技术实现思路

1、本发明要解决的问题在于提供粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖在制备同时兼具改善皮肤屏障、保湿、增强皮肤抗菌能力、更新老化角质和抗衰老的产品中的应用。

2、所述粘液玫瑰单胞菌分类号为粘液玫瑰单胞菌(roseomonas mucosa)，菌株号为dl-1，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年10月26日，保藏编号为cgmcc no.25967。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所保藏中心，邮编100101。该菌株是发明人于2021年11月从健康人皮肤筛选得到的皮肤共生菌菌株。所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖通过如下方法制备得到：将粘液玫瑰单胞菌接种于r2a培养基中，25-37℃活化12-24h，将活化的粘液玫瑰单胞菌转接于发酵培养基中，30-37℃培养24-36h得到发酵液，将发酵液经除菌、除蛋白和无水乙醇沉淀后获得胞外多糖粗品，再经过deae离心交换树脂分离纯化后得到胞外多糖纯品。

3、其中，r2a培养基组分为：酵母浸出粉0.5g/l，蛋白胨0.5g/l，酪蛋白水解物0.5g/l，葡萄糖0.5g/l，可溶性淀粉0.5g/l，磷酸氢二钾0.3g/l，无水硫酸镁0.024g/l，丙酮酸钠0.3g/l，琼脂15.0g/l，ph值7.2。

4、优选地，所述发酵培养基配方如下：碳源10-100g/l，氮源1-30g/l，无机盐0.01-50g/l，ph5.0-9.0，所述溶剂为水。

5、其中，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油、淀粉和糖蜜中的任意一种几种的组合，优选为蔗糖、葡萄糖、乳糖、柠檬酸和淀粉中的任意一种或几种的组合；所述氮源为酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(nh4)2so4、nh4cl、(nh4)2hpo4和nh4no3中的任意一种或几种的组合，优选为蛋白胨、酵母浸粉、玉米浆、(nh4)2so4、nh4cl、(nh4)2hpo4和nh4no3中的任意一种或几种的组合；所述无机盐为氯化钠、硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐和盐酸盐中的任意一种或几种的组合。

6、在一个优选的实施方式中，发酵培养基组分为胰蛋白胨17.0g/l，大豆蛋白胨3.0g/l，氯化钠5.0g/l，磷酸氢二钾2.5g/l，葡萄糖2.5g/l，ph值7.3。

7、实验表明，粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖在改善皮肤屏障，在保湿、增强皮肤抗菌能力、更新老化角质和抗衰老等方面效果优异。

8、具体地，本技术提出了粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖制剂在改善皮肤细胞状况的产品中的应用。

9、所述粘液玫瑰单胞菌dl-1具有下述性质：

10、菌落形态学特征

11、在r2a培养基32℃培养16-24h后显微镜观察到菌落为单菌落，形态如图1a所示。该分类为红螺菌目，醋杆菌科，球杆状，属于革兰氏阴性菌，产红色色素，形态呈粘液状，且单个、成对或短链状排列，具有鞭毛能够运动。在上述培养基中32℃培养12h菌体可以大量生长，其生长的温度范围是5-40℃，最适温度为30-35℃，生长的ph范围是5.0-9.5，最适ph为6.5-7.5。能在lb、r2a、tsb、bab等培养基中正常生长。

12、16s rdna序列分析

13、16s rdna序列长度1464bp。将16s rdna序列和genebank数据库中的相关种进行比较，菌株dl-1与粘液玫瑰单胞菌相似性达到99.86％。所以认定本发明的菌株为粘液玫瑰单胞菌(roseomonas mucosa)，菌株号为dl-1，并保藏在中国普通微生物菌种管理中心，保藏时间为2022年10月26日，保藏编号为cgmcc no.25967。

14、在一个具体的实施方式中，通过如下步骤制备粘液玫瑰单胞菌dl-1胞外多糖粗品：将粘液玫瑰单胞菌dl-1接种在tsb培养基中32℃培养24h，通过3000-5000rpm离心10min除菌，加入1倍体积无水乙醇后在4℃过夜得到沉淀，利用去离子水复溶后，进行冻干干燥得到胞外多糖粗品(r.mucosa dl-1unpurified eps，dl-u-eps)。

15、本技术制备得到的粘液玫瑰单胞菌胞外多糖粗品的重均分子量为1100-2000kda，包含岩藻糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、核糖。

16、具体地，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖粗品的单糖组成为：岩藻糖：阿拉伯糖：鼠李糖：半乳糖：葡萄糖：甘露糖：核糖＝0.32:0.75:6.14:1.78:52.55:37.04:1.43。

17、在一个具体的实施方式中，通过如下步骤制备粘液玫瑰单胞菌dl-1胞外多糖：将粘液玫瑰单胞菌dl-1接种在tsb培养基中32℃培养24h，通过3000-5000rpm离心10min除菌，加入1/2体积的sevage试剂除蛋白后，加入1倍体积无水乙醇后在4℃过夜得到胞外多糖粗糖沉淀，利用去离子水复溶后，通过deae-52分离纯化后进行冻干干燥得到胞外多糖纯品(r.mucosa dl-1eps，eps)。

18、本技术制备得到的粘液玫瑰单胞菌胞外多糖纯品的重均分子量为3000-3500da，包含阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸和古罗糖醛酸。

19、具体地，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖的单糖组成为：阿拉伯糖：鼠李糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖：核糖：半乳糖醛酸：葡萄糖醛酸：甘露糖醛酸：古罗糖醛酸＝0.50～0.6:1.3～1.5:1.3～2:72-78:4-7:9-11:0.9-1.1:0.5-2.4:0.6-1.4:0.6-1.4:0.9-1.7。

20、具体地，所述改善皮肤屏障为恢复细胞活力和/或正调控屏障修护相关基因的表达、促进hacat细胞的增殖；所述屏障修护相关基因包括ivl和ovol1中的至少一种。

21、具体地，在一些实施例中，本发明以hacat角质细胞为受试对象，对所述的粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖的促进细胞增殖效果进行研究。结果表明，所述的粘液玫瑰单胞菌可促进hacat角质细胞增殖。

22、具体地，在一些实施例中，本发明以hacat角质细胞为受试对象，所述粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖可以上调细胞的屏障修复相关基因ivl和ovol1的表达，改善皮肤屏障。

23、所述保湿为正调控保湿相关基因aqp3的表达。

24、所述增强皮肤抗菌能力包括上调抗菌肽相关基因的表达，所述抗菌肽相关基因包括银屑病素s100a7、β-防御素4defb4和cathelicidin家族抗菌肽ll-37中的至少一种。具体地，在一些实施例中，本发明以hacat角质细胞为受试对象，所述粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖可以上调抗菌肽相关基因s100a7、defb4和ll-37的表达，增强皮肤抗菌能力。

25、为了探究所述的粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖的抗衰老效果，本发明对细胞衰老相关的指标进行了测定，所述的指标包括细胞外基质合成、细胞外基质降解、细胞抗氧化、细胞免疫调节因子、细胞凋亡、细胞自噬、抑制细胞凋亡以及细胞生长因子中的至少一个。

26、所述抗衰老包括如下①～④中所示至少一种：

27、①、正调控细胞外基质相关基因的表达；所述细胞外基质相关基因包括丝氨酸棕榈转移酶基因sptssa、莫霍克蛋白基因mkx和信号转导蛋白基因smad3中的至少一种；

28、②、正调控抑制细胞凋亡相关基因bcl-2的表达；

29、③、正调控细胞抗氧化相关基因nrf2的表达；

30、④、正调控细胞生长因子相关基因的表达；所述细胞生长因子相关基因包括fgf1、fgf2和hgf中的至少一种。

31、具体地，在一些实施例中，本发明以hff成纤维细胞为受试对象，所述粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖可以上调细胞外基质合成相关基因sptssa、smad3和mkx的表达，促进细胞外基质的合成。

32、具体地，在一些实施例中，本发明以hff成纤维细胞为受试对象，所述粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖可以上调抗氧化相关基因nrf2的表达，增强细胞的抗氧化能力

33、具体地，在一些实施例中，本发明以hff成纤维细胞为受试对象，所述粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖可以上调抑制细胞凋亡相关基因bcl-2的表达，抑制细胞凋亡。

34、具体地，在一些实施例中，本发明以hff成纤维细胞为受试对象，所述粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖可以上调成纤维细胞生长因子相关基因fgf1、fgf2、hgf的表达，促进细胞生长。

35、所述更新老化角质包括上调降解桥粒蛋白相关基因klk5和/或上调调节角质细胞分化相关基因cd44的表达。具体地，在一些实施例中，所述粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖可以上调uvb诱导的hacat细胞的降解桥粒蛋白相关基因klk5的表达；上调调节角质细胞分化相关基因cd44的表达，所述的粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖可促进老化角质细胞间的桥粒蛋白降解使老化角质细胞脱落，同时调节角质细胞分化更新角质细胞。

36、本发明进一步提供了改善皮肤状况的产品，其原料包括r.mucosa dl-1及其胞外多糖。

37、具体地，所述的产品包括以下至少一项：

38、所述粘液玫瑰单胞菌r.mucosa dl-1的活菌制剂。

39、所述粘液玫瑰单胞菌r.mucosa dl-1胞外多糖粗品及纯品制剂。

40、更进一步的，所述产品的剂型包括膏霜类、乳液类、油剂类、水剂类、凝胶类、粉剂类、冻干类中的至少一种，本发明对此不做限定。

41、本发明还提供了改善皮肤状况的方法，包括：使用本发明所述的产品。所述的产品的使用方法包括内服或外用，所述外用包括涂抹、外敷、熏蒸或注射，本发明对此不做限定。

42、本发明提供的粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖在改善皮肤屏障、保湿、增强皮肤抗菌能力、更新老化角质和抗衰老等方面具有优异的效果，适用于制备改善皮肤相关功能的食品、药品、化妆品等。