一种具有骨靶向功能混合纳米粒的制备方法及其应用

本发明属于药物递送系统，特别涉及一种具有骨靶向功能混合纳米粒的制备方法及其应用。

背景技术：

1、骨病是与骨和关节相关疾病的总称，主要包括骨质疏松、骨折愈合障碍、关节炎和多种急慢性颈肩腰腿疼痛等相关的疾病。除了常见骨病以外，骨也是实体瘤常见的转移部位，发生骨转移后的患者生存期约为12-53个月，在此期间患者也会面临骨骼并发症的风险，如病理性骨折、高钙血症等。尽管现在针对各类骨病及骨转移已经有一些相应的药物研究，但是，由于骨组织硬度大、血流量低、渗透性差，生理生化过程特殊，治疗骨病的药物几乎都存在按一般给药途径难以有效转运到作用部位、疗效差的问题。大多数药物需要全身给药，为了在骨组织达到有效治疗浓度，只有加大给药剂量，这不仅降低药物治疗指数，还对患者的其他器官组织产生严重的毒副作用。

2、近年来，胶束和纳米粒作为药物载体的应用越来越广泛。随着纳米技术的发展，现已开发多种人工纳米载体用于体内药物递送，由于人体组织包含纳米尺度(1-100nm)的分层结构，纳米载体尺寸与人体组织结构尺寸接近，控制纳米载体尺寸，可使其易于穿透体内生物屏障，有效提高了药物体内递送效率。这些纳米载体相对于传统药物具有以下优点：增加药物溶解度，提高药物稳定性与血液循环时间，改变了药物全身生物分布，如脂质体、聚合物、聚合肽、磷酸钙和金属纳米颗粒等。

3、但由于这些传统的药物递送系统缺乏靶向性，且存在肝脏积聚及网状内皮系统(reticular endothelial system，res)清除的问题，会导致骨组织药物分布浓度低，因此通过对脂质体表面peg、骨组织和ob靶向分子进行修饰，构建骨靶向药物递送系统可有效提高药物在骨组织的富集，增强药物治疗、肿瘤抑制效果。

4、目前常见的骨靶向分子主要是寡肽类和双磷酸盐类。其中寡肽类的主要代表为八个重复序列的天冬氨酸八肽asp8和天冬氨酸与丝氨酸结合的短肽(aspserser)6。有研究证明，asp8的短肽序列在体外和体内只与硬组织(骨和牙齿)相互作用(kasugai et al.,2000；yokogawa et al.,2001；ouyang et al.,2009；murphy et al.,2007；ogawa et al.,2013))。事实上，天冬氨酸肽序列也已被几个小组应用于靶向药物到骨组织。例如，在临床前动物研究中已报道能够促进小分子量药物的骨积累，如放射镓标记的骨显像剂(ogawaet al.，2013)。

5、dspe-peg2000是美国fda批准的药用高分子材料，无毒、无免疫原性和无抗原性，常用来包裹蛋白质、多肽等药物。对peg进行修饰得到的dspe-peg-mal上的马来酰亚胺可以与天冬氨酸八肽上的巯基进行偶联，合成具有骨靶向的dspe-peg-asp8聚合物。虽然改性后的asp8纳米载体可在一定程度上发挥骨靶向治疗作用，但其目标并不完全是骨肿瘤细胞，这是因为asp8主要针对骨结构而不是肿瘤细胞。

6、ros响应性纳米材料能够对细胞内的活性氧(ros)做出反应，并释放出药物或诊断物质。这些纳米材料已经被广泛研究用于癌症治疗和诊断，因为癌细胞通常具有更高的ros水平。苯硼酸及其酯可以选择性地与过氧化氢反应形成硼酸中间体，该中间体快速水解释放离去基，形成苯酚和硼酸酯或硼酸。硼酸及其酯没有内在的毒性问题，且硼酸最终产物被认为对人类是无毒的。此外，硼酸及其酯对过氧化氢的选择性反应性为检测内源性过氧化氢的产生提供了一种化学特异性、生物相容的反应方法。这种方法被当做过氧化氢的高选择性荧光探针运用于细胞成像。这些特性加上它们的相对稳定性，使苯硼酸及其酯类成为开发有效的ros激活前药的候选触发单元。最近，cohen的研究小组使用硼酸酯作为h2o2敏感的触发器来开发过氧化氢激活的mmpis(major jourden jl et al.，2010)。

7、为了满足将单一配体修饰的纳米载体向主动靶向肿瘤细胞给药系统转变这一需求，将合成的dspe-peg-asp8聚合物与具有过氧化氢响应性的苯硼酸酯-透明质酸(ha)共聚物共同制备得到混合纳米粒，可增加纳米载体的肿瘤靶向性，将药物选择性地递送至肿瘤细胞，使其蓄积在肿瘤细胞部位。

8、因此本发明的发明人公开了一种dspe-peg-asp8/苯硼酸酯-ha骨靶向混合纳米粒的制备。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种具有骨靶向功能混合纳米粒的制备方法。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：其步骤如下：

3、(1)取天冬氨酸八重复序列与二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-马来酰亚胺以摩尔比1:1混合，溶于pbs中，所述pbs溶液ph为7.4，天冬氨酸八重复序列的巯基和二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-马来酰亚胺的双键偶联生成硫醚键，生成dspe-peg-asp8聚合物；

4、(2)取4-羟甲基苯硼酸频哪醇酯和透明质酸，使其在dcc和dmap溶解于无水二甲基亚砜的条件下，4-羟甲基苯硼酸频哪醇酯的羟基和透明质酸的羧基发生酯化反应，可产生苯硼酸-透明质酸共聚物；

5、(3)将步骤(1)和步骤(2)制得的聚合物混合制备得到具有骨靶向功能的混合纳米粒。

6、本发明的进一步设置是：步骤(1)中，将溶于pbs中形成的溶液，在室温下搅拌反应24h，纯水透析48小时，最后将透析完的溶液冻干得到白色固体即为dspe-peg-asp8聚合物。

7、本发明的进一步设置是：步骤(2)中，将透明质酸、dcc和dmap溶解在45ml无水二甲基亚砜中，将溶液在氮气保护下搅拌30min以活化透明质酸的羟基，随后加入1.0g 4-羟甲基苯硼酸频哪醇酯，在氮气中，250rpm的搅拌下进行反应过夜，将反应溶液用纯水透析48h，以除去dmap和其它水不溶性副产物，冷冻干燥产品；然后将产品分散在无水乙醇中，借助超声波，以除去未反应的ha；最后将沉淀的产物冻干，得白色固体，即为苯硼酸酯-ha共聚物。

8、本发明的进一步设置是：dspe-peg-asp8聚合物和苯硼酸酯-ha共聚物溶于10ml二甲基亚砜，搅拌状态下滴加到100ml pbs缓冲液，搅拌维持30min，室温下避光搅拌4h，然后通过透析袋透析24h，除去有机溶剂，最后冷冻干燥保存。

9、本发明公开了一种通过所述方法制备的混合纳米粒在制备骨病药物中的应用。

10、本发明的进一步设置是：混合纳米粒作为给药载体在制备骨肿瘤药物中的应用。

11、综上所述，本发明的有益效果是：本发明中介绍的具有骨靶向功能混合纳米粒子，通过制备dspe-peg-asp8聚合物和苯硼酸-透明质酸共聚物，再将两者混合制得具有过氧化氢响应性的骨靶向纳米递送系统，该纳米粒能包载一些难溶性的药物分子，突破了传统的载体包载药物的给药模式，具有了过氧化氢响应性，能够靶向选择骨组织，并利用肿瘤部位和炎症性疾病微环境下高表达活性氧自由基的特点，通过h2o2的触发，实现包裹的活性药物的快速靶向释放，不伤害到正常的细胞，并且其代谢产物具有良好的生物相容性，可作为潜在的药物靶向递送系统。