以PTPN14或其编码基因为靶点的物质在制备治疗血管内膜增生产品中的应用

本发明属于生物医药领域，具体涉及以ptpn14或其编码基因为靶点的物质在制备治疗血管内膜增生产品中的应用。

背景技术：

1、长久以来，心血管疾病的患病率居高不下，由此引发的死亡事件也逐年增多。心血管疾病是一类循环系统疾病，包括冠心病、外周动脉疾病、心肌病等涉及心脏、血管病变的疾病。其中冠心病也称为冠状动脉疾病，是最常见的一种心血管疾病，动脉粥样硬化是诱发冠状动脉疾病的主要病因。冠状动脉血管内斑块沉积，致使动脉管腔狭窄，导致心脏血液供应受阻引发心肌缺血。临床上可采用血管成形术、旁路移植术等治疗手段恢复血流，但不可避免地会损伤血管内膜层，中膜层的平滑肌细胞暴露于血流剪切力、趋化因子和细胞因子等病理刺激因素向内膜下发生迁移增殖，可诱发不良的血管重塑。血管再狭窄引发的血管功能不全具有严重危害，明确平滑肌细胞参与病理性重塑的作用机理至关重要。

2、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,vsmcs)定位于正常血管中膜层，在维持血管弹性、正常管径、血流分布和血管收缩等生理功能方面发挥着重要作用，平滑肌细胞参与动脉粥样硬化、高血压、动脉瘤、主动脉夹层、肺动脉高压等心血管疾病的发生与进展。血管平滑肌细胞具有表型可塑性，当血管发生损伤时，位于中膜层的血管平滑肌细胞向血管内膜下发生迁移，并发生病理性增殖，从而引起血管管腔内内膜新生，造成血管狭窄。在此病理过程中，平滑肌细胞发生表型转化、迁移以及过度增殖，细胞外基质状态也发生改变，透明质酸逐渐减少，胶原纤维发生沉积。平滑肌细胞的表型转化过程由完全分化状态转变为去分化状态，表现为平滑肌细胞收缩型标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)、平滑肌22α-蛋白(sm22)、钙调宁蛋白(cnn1)、平滑肌肌球蛋白重链(smmhc)的表达减少，分泌型标志物蛋白波形蛋白(vimentin)、基质gla蛋白(mgp)、骨桥蛋白(osteopontin)的表达增加，在该过程的早期阶段，通常意义上认为是一个可逆的过程。除此之外，细胞内内质网、核糖体和高尔基体的含量增多，基质金属蛋白酶mmps含量明显增加，使细胞大量合成并分泌细胞外基质，并伴随着平滑肌细胞的迁移增殖能力增加。

3、ptpn14又称pez、ptp36、ptpd2，是非跨膜酪氨酸磷酸酶的成员，属于经典的磷酸酪氨酸(p-y)特异性磷酸酶。1995年首次在正常人体乳腺组织中被发现，并广泛表达于骨骼肌、肾、肺、胎盘等多种组织中。ptpn14具有与细胞骨架相关的n端ferm结构域(band 4.1,ezrin,radixin,moesin)，包含酸性区域的中间连接区ppxy结构域可以与其他含有推测的sh3结构域的蛋白质相互作用，以及参与催化磷酸化的c端保守ptp结构域。ptpn14在平滑肌细胞中的功能以及内膜增生中的作用尚不清楚。因此，本研究旨在探索ptpn14在平滑肌细胞中生物学功能以及参与调控内膜新生进程的作用机制，为防治内膜增生寻找治疗靶点。

技术实现思路

1、本发明所要解决的一个技术问题是如何抑制何抑制血管内膜增生。

2、为了解决以上技术问题，本发明提供了抑制细胞中ptpn14表达的物质和抑制细胞中ptpn14活性的物质的下述任一种用途：

3、1、抑制ptpn14基因表达的物质在制备治疗血管内膜增生或/和预防血管内膜增生的产品中的应用。

4、2、抑制ptpn14基因表达的物质在制备抑制平滑肌细胞增殖和/或迁移的产品中的应用。

5、3、抑制ptpn14蛋白活性的物质在制备治疗血管内膜增生或/和预防血管内膜增生的产品中的应用。

6、4、抑制ptpn14蛋白活性的物质在制备抑制平滑肌细胞增殖和/或迁移的产品的应用。

7、5、降低ptpn14蛋白含量的物质在制备治疗血管内膜增生或/和预防血管内膜增生的产品中的应用。

8、6、降低ptpn14蛋白含量的物质在制备抑制平滑肌细胞增殖和/或迁移的产品的应用。

9、上述应用中，所述抑制ptpn14基因表达的物质或抑制ptpn14蛋白活性的物质可为下述中任一种生物材料：

10、1)双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐；

11、b1)产生1)所述双链rna分子的dna分子；

12、b2)含有b1)所述dna分子的表达盒；

13、b3)含有b1)所述dna分子的重组载体；

14、b4)含有b2)所述表达盒的重组载体；

15、b5)含有b1)所述dna分子的重组微生物；

16、b6)含有b2)所述表达盒的重组微生物；

17、b7)含有b3)所述重组载体的重组微生物；

18、b8)含有b4)所述重组载体的重组微生物；

19、b9)含有b1)所述dna分子的转基因动物细胞系；

20、b10)含有b2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

21、b11)含有b3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

22、b12)含有b4)所述重组载体的转基因动物细胞系；

23、b13)含有b1)所述dna分子的转基因植物细胞系。

24、上述应用中，所述抑制ptpn14基因表达的物质或抑制ptpn14蛋白活性的物质为双链rna分子，所述双链rna分子可为siptpn14(santa cruz biotechnology，货号：sc-62777)。

25、对照sirna与目的siptpn14购买于santa cruz biotechnology(对照sinc货号sc-37007；siptpn14货号：sc-62777)。

26、上述应用中，所述重组微生物可为表达所述sirna或shrna的重组慢病毒。

27、上述应用中，所述细胞可为哺乳动物细胞，如人或鼠。

28、上述应用中，所述ptpn14可为哺乳动物细胞的ptpn14，如人ptpn14或鼠ptpn14。

29、上述应用中，所述平滑肌细胞为人平滑肌细胞或鼠平滑肌细胞。

30、所述平滑肌细胞可为血管平滑肌细胞。

31、本发明还提供了治疗血管内膜增生或/和预防血管内膜增生的产品，所述产品含有下述中任一种生物材料：

32、1)双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐；

33、b1)产生1)所述双链rna分子的dna分子；

34、b2)含有b1)所述dna分子的表达盒；

35、b3)含有b1)所述dna分子的重组载体；

36、b4)含有b2)所述表达盒的重组载体；

37、b5)含有b1)所述dna分子的重组微生物；

38、b6)含有b2)所述表达盒的重组微生物；

39、b7)含有b3)所述重组载体的重组微生物；

40、b8)含有b4)所述重组载体的重组微生物；

41、b9)含有b1)所述dna分子的转基因动物细胞系；

42、b10)含有b2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

43、b11)含有b3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

44、b12)含有b4)所述重组载体的转基因动物细胞系；

45、b13)含有b1)所述dna分子的转基因植物细胞系。

46、本发明还提供了抑制平滑肌细胞增殖和/或迁移的产品，所述产品含有下述中任一种生物材料：

47、1)双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐；

48、b1)产生1)所述双链rna分子的dna分子；

49、b2)含有b1)所述dna分子的表达盒；

50、b3)含有b1)所述dna分子的重组载体；

51、b4)含有b2)所述表达盒的重组载体；

52、b5)含有b1)所述dna分子的重组微生物；

53、b6)含有b2)所述表达盒的重组微生物；

54、b7)含有b3)所述重组载体的重组微生物；

55、b8)含有b4)所述重组载体的重组微生物；

56、b9)含有b1)所述dna分子的转基因动物细胞系；

57、b10)含有b2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

58、b11)含有b3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

59、b12)含有b4)所述重组载体的转基因动物细胞系；

60、b13)含有b1)所述dna分子的转基因植物细胞系。

61、上述应用中，所述产品可为药物或疫苗。

62、本发明所提供的治疗血管内膜增生或/和预防血管内膜增生、或/和抑制平滑肌细胞增殖和/或迁移的药物，含有所述双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐。

63、上述药物的剂型可为片剂、胶囊、滴丸、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂或冻干粉针剂。

64、上文中，所述治疗血管内膜增生、或/和预防血管内膜增生、或/和抑制平滑肌细胞增殖和/或迁移的产品的药物的活性成分可为所述双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐，所述治疗血管内膜增生或/和预防血管内膜增生、或/和抑制平滑肌细胞增殖和/或迁移的药物的活性成分还可含有其他物质，其他物质本领域技术人员可根据所述治疗血管内膜增生或/和预防血管内膜增生、或/和抑制平滑肌细胞增殖和/或迁移的药物的效果确定。

65、上文中，所述治疗血管内膜增生或/和预防血管内膜增生、或/和抑制平滑肌细胞增殖和/或迁移的药物，除含有所述双链rna分子、其修饰物、或其药学上可接受的盐外，还可含有适宜的载体或赋形剂。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、ph调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。上述给药途径优选的是注射给药。

66、上述产品中，所述平滑肌细胞为人平滑肌细胞或鼠平滑肌细胞。

67、上述产品中，所述平滑肌细胞可为血管平滑肌细胞。

68、为了明确ptpn14在平滑肌细胞中的功能，在血管平滑肌细胞中敲低ptpn14的表达，并用诱导因子pdgf-bb刺激，通过划痕实验、transwell迁移实验、免疫荧光ki-67染色，评估平滑肌细胞的迁移、增殖能力；在体内动物实验层面上，通过对c57bl/6小鼠和平滑肌特异性敲除ptpn14的基因小鼠进行左颈总动脉导丝拉伤手术以构建内膜新生模型，探究ptpn14在新生内膜中的差异表达和作用。

69、本研究证实ptpn14在新生内膜增生的平滑肌细胞中富集。ptpn14在小鼠导丝拉伤的模型中响应血管损伤上调表达水平。ptpn14促进平滑肌细胞迁移、增殖和表型转化，从而加重内膜增生的进程。说明ptpn14的高表达可促进损伤介导的血管重构过程中内膜增生的发生和发展，抑制ptpn14的表达可以抑制血管内膜增生。