miR-148a-5p在治疗糖尿病肾病中的用途

本发明涉及生物医药，具体涉及mir-148a-5p在治疗糖尿病肾病中的用途。

背景技术：

1、目前，糖尿病(diabetes mellitus，dm)发病率在世界范围内不断增加，并正成为一个重大公共卫生问题。糖尿病肾病(diabetic kidney disease，dkd)是终末期肾脏疾病的主要原因，与dm的发病率和死亡率密切相关。近10年来，我国dkd的患病率和发病率显著增加，这严重影响人类生命健康。dkd进展过程中，肾小球基底膜增厚、系膜基质扩张、肾小球高滤过和肾小管间质纤维化是肾脏形态学和超微结构的改变，其发生与发展包括多条错综复杂的病理生理通路，因此，研究控制dkd发展的分子过程和识别新的治疗靶点是至关重要的，预防、停止、治疗和逆转dkd的新型治疗技术仍然需要探索。dkd是一个复杂的生理过程，涉及各种细胞和分子，而骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cells,bmscs)是参与其中最重要的细胞之一，它具有定向迁移到炎症、缺血和损伤部位的能力，并分化为骨、软骨和脂肪细胞，参与损伤修复。

2、2006年进行的一项研究报告称，bmscs可以增加dm小鼠产生胰岛素的β细胞，并减少系膜增厚和巨噬细胞浸润，这项研究首次证明了mscs治疗dkd的可能性，提高mscs的归巢能力可能是其治疗效果的关键。从那时起，越来越多的研究进展使得mscs成为dkd的可行选择。mscs归巢是一个由特定分子相互作用介导的多步骤过程。尽管自20世纪70年代以来，人们一直在研究bmscs归巢的具体机制，但这一过程的许多方面仍然未知，需要进一步确认。总之，bmscs的归巢对治疗dkd有积极影响。近年来，利用bmscs、其他干细胞和细胞衍生物的修复作用去减少受损肾脏中的肾小球硬化、间质纤维化、小管间质炎症和氧化应激己逐渐成为临床dkd研究的热点。然而bmscs靶向归巢到肾脏等受损组织的效率低且使用率有限，因此，有必要找到有效途径来促进bmscs的归巢，使内源性或外源性bmscs更有效地迁移到损伤部位，有利于dkd的恢复与治疗。

3、微小核糖核酸(microrna,mirna)是一种小分子内源性rna，可通过转录后调节基因表达，从细胞核中输出，作为短链成熟mirna发挥作用，长度为18-24个核苷酸，通过特异性结合到目标mrna的3'utr区域，从而抑制其翻译或降解，参与转录后基因表达调控。由于mirna是细胞稳态的关键调节因子，其失调会造成细胞和器官损伤。近年来大量研究显示，mirna参与调控dkd中的系膜细胞增殖和炎症，足细胞损伤，肾小管损伤，这表明mirna和dkd的发展密切相关。此外，mirna几乎参与所有细胞过程的调控，目前研究认为其可以调控多种细胞的迁移、分化和代谢过程，包括dkd环境下细胞功能的改变。例如，高糖环境下，mir-29b通过对其下游靶基因hif3a的负调控，进而影响胎盘滋养层细胞的增殖、活性、凋亡、迁移和侵袭等功能；上调mir-125b-5p来抑制hif-1α/sp1介导的robo4表达，可明显改善dm状态下人视网膜色素上皮细胞的细胞功能，包括恢复降低的细胞活力、降低的细胞间通透性和降低的细胞迁移能力。同时，越来越多的研究证实了mirna在bmscs中的影响作用，上调的mir-100-5p通过抑制bmscs的迁移和成骨分化参与非创伤性股骨头坏死的发病机制；stat3/mir-211/stat5a信号通路在bmscs的迁移过程中起到关键作用，通过过表达mir-211来增强mscs的迁移能力，从而促进mscs移植的治疗效果来改善心梗后的心功能。然而，很少有研究报道mirna如何调控dkd环境下bmscs的迁移，所以mirna在dkd中bmscs发挥的作用及其机制需要进一步的探索。

4、wnt家族由19种不同的wnt配体组成，参与调节细胞各种代谢活动，如细胞增殖、分化、迁移和凋亡。wnt信号途径包括经典的wnt/β-catenin信号途径、平面细胞极性途径、wnt/ca2+途径、调节纺锤体定向途径和非对称细胞分裂的细胞内途径。大致分为两类：经典的wnt信号通路，它依赖于β-catenin；非经典的wnt信号通路，它与β-catenin无关。wnt5a在wnt家族中研究较为广泛，它可以分别通过wnt/β-catenin经典信号通路和非典型wnt信号通路调控器官发育和细胞功能。先前的研究表明，wnt5a促进了肾脏疾病的发展，如dkd。而wnt/β-catenin信号通路在dkd发病中起重要作用，大量研究表明，特异性阻断wnt/β-catenin通路可阻止dkd进展，包括消除肾小球系膜细胞的增殖和细胞外基质的表达。因此，阻断wnt/β-catenin信号通路的激活是预防dkd的重要策略。此外，在人脐带间充质干细胞中，可以通过调控wnt/β-catenin通路来影响体外皮肤细胞的增殖和迁移，在皮肤伤口愈合治疗策略中提供重要意义。先前也有研究证实wnt/β-catenin信号通路参与了mir-124对mscs趋化迁移的抑制作用，指导mscs向损伤和炎症区域分泌的肝细胞生长因子处迁移。然而，mirna与wnt/β-catenin的相互作用机制在dkd环境下的bmscs未见报道。

技术实现思路

1、本发明研究了调控dkd bmscs迁移的关键mirna及作用机制，发现dkd能下调mir-148a-5p的表达抑制bmscs迁移，而wnt5a是mir-148a-5p调控dkd bmscs迁移的关键效应分子。基于此，本发明保护如下技术方案：

2、mir-148a-5p表达促进剂在制备防治糖尿病肾病的药物中的用途。

3、所述mir-148a-5p表达促进剂为mir-148a-5p mimics。

4、本发明还保护mir-148a-5p作为靶标在筛选防治糖尿病肾病的药物中的用途。

5、所述药物促进mir-148a-5p的表达。

6、在上述任意的用途技术方案中，所述mir-148a-5p的序列如seq id no.9所示。

7、在上述任意的用途技术方案中，mir-148a-5p表达提高促进bmscs的归巢。

8、在上述任意的用途技术方案中，mir-148a-5p表达的增加上调dkd bmscs迁移相关因子pak1、mmp9的表达。

9、在上述任意的用途技术方案中，mir-148a-5p通过靶向wnt5a介导wnt信号通路调控dkd中bmscs的迁移，mir-148a-5p对wnt5a起负向调控的作用。

10、在上述任意的用途技术方案中，mir-148a-5p通过靶基因wnt5a介导的wnt/β-catenin经典信号途径对dkd bmscs发挥作用。

11、本发明的研究路线如下：

12、从c57bl/6j雄性小鼠中提取原代bmscs进行培养，培养至第三代后按照国际干细胞标准对其鉴定，然后通过模拟dkd微环境，构建dkd bmscs模型。通过划痕实验验证，与正常bmscs相比，dkd中bmscs迁移能力明显下降。

13、通过芯片数据分析和qrt-pcr实验验证mir-148a-5p可能是一个参与调控dkdbmscs的重要因子，在dkd bmscs中的表达异常降低。

14、研究mir-148a-5p对dkd bmscs迁移的影响，我们构建mir-148a-5p的mimics和inhibitor，成功转染到bmscs后检测细胞迁移能力的变化，结果证明mir-148a-5p可以促进bmscs的迁移。

15、为探究mir-148a-5p调控dkd bmscs迁移的具体机制，通过生信靶基因预测、双荧光素酶报告基因和westernblot验证wnt5a是mir-148a-5p的重要靶点。wnt5a是wnt经典信号通路上的重要蛋白，wnt/β-catenin通路对包括dkd在内的多种肾脏疾病起着重要作用。特异性阻断wnt/β-catenin通路可阻止dkd进展，包括消除肾小球中系膜细胞增殖和ecm表达。dkd可导致wnt/β-catenin信号通路的过度激活，从而引起足细胞和小管上皮细胞凋亡和上皮间充质转化，并导致肾损伤和纤维化。因此，阻断wnt/β-catenin信号通路的激活是预防dkd的重要策略。我们通过qrt-pcr和western blot证实dkd bmscs中wnt5a及β-catenin的表达异常上调。成功构建并转染wnt5a的过表达质粒和sirna后，通过westernblot进行验证，发现在conbmscs中，过表达wnt5a后bmscs迁移能力明显下降，而在dkd bmscs中敲低wnt5a后bmscs迁移能力明显增强。共转染mir-148a-5p和wnt5a，我们发现wnt5a可以逆转mir-148a-5p对迁移能力的影响。以上提示，mir-148a-5p通过wnt5a/β-catenin调控dkd bmscs的迁移。

16、本发明的有益效果是：

17、bmscs的归巢对于dkd具有重要作用，本发明研究了调控dkd bmscs迁移的关键mirna及作用机制，发现dkd能下调mir-148a-5p的表达抑制bmscs迁移，而wnt5a是mir-148a-5p调控dkd bmscs迁移的关键效应分子。本发明研究的完成阐明dkd bmscs迁移的分子作用新的机制，为今后dkd的缓解提供新的靶点和治疗策略，为dkd的治疗提供新的方向，具有重要的科学研究意义和临床应用前景。