一种胃肠道微环境响应型纳米涂层包覆益生菌的制备方法及其应用

本发明属于生物材料，具体涉及一种胃肠道微环境响应型纳米涂层包覆益生菌的制备方法及其应用。

背景技术：

1、肠道菌群在维持肠道环境稳态和调节人体健康方面起着至关重要的作用。目前已有研究证实肠道菌群失调与多种疾病有关，包括炎症性肠病、肥胖、糖尿病、抑郁症和癌症。细菌在肠道中持续产生关键的生物分子，可以重新编程肠道菌群。因此，基于细菌的疗法是一种很有前景的治疗肠道菌群失调的方法。

2、迄今为止，粪菌移植被认为是一种可行的治疗溃疡性结肠炎的方法，但由于存在潜在的病原体感染风险和对患者侵入性实施等副作用而在临床上受到限制。目前，基因工程细菌已被用于增强治疗性微生物对恶劣胃肠道条件的耐受性，然而其存在将耐药基因转移到肠道中的健康细菌的潜在安全问题。此外，口服益生菌具有无创和患者依从性好的优势，已作为一种微生态制剂用于治疗结肠炎。益生菌可以附着在肠道上皮细胞，实现肠道内定植，重建肠道微环境。然而，由于胃肠道中的恶劣环境(如低ph值、消化酶和胆汁酸等)，益生菌的生物利用度和治疗效率有待进一步提高。因此，保持口服益生菌的生长增殖能力至关重要。

3、口服益生菌的剂型，包括液体、胶囊和药丸等，均已被广泛用于保护益生菌的活力。然而，这些剂型仍不足以免除口服益生菌的胃肠道环境侵害及提高其生存率。此外，在临床治疗肠道疾病时，口服益生菌通常与其他治疗药物联合使用，但是口服不同剂型的多种药物可能会因为药物释放途径不同而降低联合治疗的效率，并且每天重复服用不同剂型的多种药物也会降低患者的依从性。因此，有必要探究一种方案，不仅能够提升口服益生菌的生物利用度以及治疗效率，最好还能避免降低患者的依从性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决以下问题：

2、一、现有益生菌包覆策略存在益生菌生物利用度低、治疗效果不理想的问题；

3、二、在益生菌联合药物治疗时，会降低患者依从性的问题；

4、为此，提供一种胃肠道微环境响应型纳米涂层包覆益生菌的制备方法及其应用。

5、本发明的构思：

6、本发明研究团队针对现有技术中存在的缺点，进行了深入的探究，认为造成上述问题的原因主要是益生菌包覆形式、包覆状态以及联合药物治疗时口服剂型的多样性。要解决上述问题，本发明研究团队认为：

7、首先，改变益生菌的包覆形式，使外侧的包覆层不仅能够抵抗胃液中的强酸和消化酶，还能在肠道顺利降解，恢复被包覆益生菌的生物活性，进而提高生物利用度和治疗效果；海藻酸盐(alg)作为一种从褐藻多糖中提取的食品添加剂，具有良好的ph响应性和较高的生物相容性，研究团队拟将其作为本发明技术方案中胃肠道微环境响应型和保护型涂层材料；

8、其次，改变益生菌的包覆状态，尽量不在同一包覆层内同时包覆多个或大量菌体，旨在避免即便能够抵抗胃液中的强酸和消化酶，但由于同一包覆层中各个益生菌所处的环境不同，在达到释放条件时，各个益生菌无法同步进行治疗，达不到治疗需要的用量，仍然存在降低生物利用度以及治疗效果的风险；

9、最后，避免在联合治疗时口服剂型的多样性，保证患者的依从性，统一益生菌与药物的释放途径，以此来降低因释放途径不同对治疗效率产生的影响。

10、基于上述发明构思，为实现上述发明目的，本发明提供的具体技术方案如下：

11、一种胃肠道微环境响应型纳米涂层包覆益生菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

12、1)培养益生菌至对数生长期，并使用ph为7.2-7.4的磷酸盐缓冲溶液清洗多次(确保清洗干净，无培养基残留)，得到益生菌；

13、2)采用预冷的氯化钙的磷酸盐缓冲溶液重悬步骤1)得到的益生菌并涡旋；此处预冷主要是为了防止后续涡旋导致温度过高，影响益生菌的状态；

14、3)向步骤2)得到的溶液中加入海藻酸盐溶液并涡旋，得到益生菌悬液；

15、4)调节步骤3)得到的益生菌悬液的ph至3.0-4.0，并使用ph为3.0-4.0磷酸盐缓冲溶液清洗多次，离心得到胃肠道微环境响应型纳米涂层包覆益生菌。在该ph为3.0-4.0的环境下，能使海藻酸盐与ca2+形成凝胶，可实现包覆单个益生菌的目的。

16、进一步地，针对联合药物治疗情况，可以在步骤2)中，采用2-6℃(优选4℃)预冷的氯化钙的磷酸盐缓冲溶液重悬步骤1)得到的益生菌后，加入肠道治疗药物并涡旋。

17、进一步地，步骤2)中，氯化钙的磷酸盐缓冲溶液浓度为13.9mm，涡旋转速为2000-3000rpm，涡旋时间为5-10min。

18、进一步地，步骤3)中，海藻酸盐溶液浓度为20mg/ml，涡旋转速为2000-3000rpm，涡旋时间为5-10min；采用该浓度的海藻酸盐溶液，能够在不影响益生菌正常生长增殖的前提下实现包覆效果。

19、进一步地，步骤4)中，采用盐酸调节益生菌悬液的ph，盐酸浓度为0.1m。

20、进一步地，步骤3)中，海藻酸盐为海藻酸钠。

21、进一步地，所述益生菌为escherichia coli nissle 1917；

22、所述治疗药物为5-氨基水杨酸。

23、同时，本发明还提供了一种胃肠道微环境响应型纳米涂层包覆益生菌，其特殊之处在于：采用上述方法制备获得，每个益生菌菌体被纳米涂层独立包覆或同时包覆有若干肠道治疗药物，即包括纳米涂层壳体以及包覆在内的单个益生菌菌体，或者包括纳米涂层壳体以及包覆在内的单个益生菌菌体和若干肠道治疗药物。

24、以及，上述方法制备的胃肠道微环境响应型纳米涂层包覆益生菌在制备预防或治疗肠道疾病的生物材料中的应用，比如治疗肠道菌群失调、结肠炎等。

25、一种预防或治疗肠道疾病的生物材料，其特殊之处在于：有效成分为上述方法制备的胃肠道微环境响应型纳米涂层包覆益生菌。

26、本发明的原理：

27、益生菌的表面带负电荷，加入氯化钙后，钙离子通过静电相互作用结合在每个独立的益生菌菌体表面；再加入海藻酸钠后，海藻酸盐的多糖结构与钙离子螯合，在每个独立的益生菌菌体表面形成涂层，如若进行联合治疗，也可同时包覆若干小分子治疗药物，在胃酸中保护益生菌和治疗药物。到达肠道中性环境后，海藻酸盐涂层溶解，释放出受抑制的益生菌和治疗药物，益生菌抑制病原菌的生长，维持肠道固有菌群，保持肠道内菌群平衡。同时结合药物的抗炎作用，达到协同治疗肠道疾病的效果，本发明同时适用于包封不同的临床药物和各种微生物，加强肠道疾病的治疗。

28、本发明的优点：

29、1.采用本发明方法可以在单个益生菌表面形成胃肠道微环境响应型纳米涂层，在达到释放条件时，每个益生菌同步释放，实现同步精准治疗，提高生物利用度以及治疗效果。

30、2.采用本发明方法还可以利用功能纳米涂层同时包覆单个益生菌和若干药物，在达到释放条件时，实现益生菌和药物的同时释放，即统一释放途径，达到协同治疗效果，同时，保证患者的依从性。

31、3.该方法简单、安全、适用范围广。海藻酸盐是一种从褐藻多糖中提取的食品添加剂，具有较高的生物相容性。并且，该方法适用于包封不同的临床药物和各种微生物，通过解决肠道菌群失调问题，对肠道疾病产生协同治疗效果。