呼吸道合胞病毒特异性结合分子的用途的制作方法

本公开涉及医学及免疫学领域，具体地说，涉及呼吸道合胞病毒特异性结合分子，制备上述分子的方法及其在预防和治疗呼吸道合胞病毒感染的用途。

背景技术：

1、呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus，rsv)广泛分布于世界各地，是导致婴幼儿、老年人和免疫力低下的成年人下呼吸道疾病(low respiratoryillness，lri)的最常见的病毒性病原体之一。几乎所有儿童2岁时都经历过1次或多次感染，感染的高峰年龄为2个月至8个月。rsv是婴儿、小龄儿童下呼吸道感染的首要原因，也是年幼儿童因呼吸道疾病住院的首要原因。在婴幼儿住院病例中，有40％～50％的毛细支气管炎和25％的肺炎是rsv感染所致。而且多项研究还表明，婴儿严重感染是以后发生哮喘的高危因素，其严重性远远超出其他微生物病原。

2、rsv自然感染产生的免疫不充分，不能产生持久免疫力，因此，rsv感染的显著特征是前次感染在体内产生的抗体不能提供永久保护，在同一个流行季节，不同亚型的rsv可引起再次感染，即使发生多次rsv自然感染也不能诱导上呼吸道对病毒感染产生终身的免疫保护，因此重复感染十分常见。

3、目前，预防和治疗rsv感染的方法包括疫苗开发、抗病毒化合物(利巴韦林)、反义药物、rna干扰技术以及抗体产品，例如免疫球蛋白或静脉注射单克隆抗体。单克隆抗体帕利珠单抗已被批准用于高风险儿童中的rsv预防。然而帕利珠单抗是一种昂贵的人源化单克隆抗体，仅能通过被动免疫接种用作预防性给药，利巴韦林作为一种核苷抗代谢物，目前尚无足够的证据证实利巴韦林在治疗rsv感染中的有效性，且存在致畸作用。

4、因此，迫切需要开发新的抗rsv药物，尤其是可治疗rsv感染的药物。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的问题，本公开提供了特异性结合呼吸道合胞病毒(rsv)表面糖蛋白融合蛋白的分离的人或人源化抗体或其抗原结合片段。此外，本公开还提供了编码上述抗体及其抗原结合片段的核酸序列；包含上述核酸序列的载体和相应的宿主细胞；以及上述中和抗体在预防和治疗rsv感染中的应用。

2、第一方面，本公开提供了特异性结合呼吸道合胞病毒(rsv)表面糖蛋白融合蛋白的分离的人或人源化抗体或其抗原结合片段，其包括轻链可变区和重链可变区：

3、重链可变区包括：(1)如seq id no：1所示氨基酸序列的cdr1或具有同等功能的功能性活性cdr变体，(2)如seq id no：2所示氨基酸序列的cdr2或具有同等功能的功能性活性cdr变体，(3)如seq id no：3所示氨基酸序列的cdr3或具有同等功能的功能性活性cdr变体；

4、和/或，

5、轻链可变区包括：(1)如seq id no：4所示氨基酸序列的cdr1或具有同等功能的功能性活性cdr变体，(2)如seq id no：5所示氨基酸序列的cdr2或具有同等功能的功能性活性cdr变体，(3)如seq id no：6所示氨基酸序列的cdr3或具有同等功能的功能性活性cdr变体。

6、在一个具体的实施方案中，所述抗rsv抗体及其抗原片段包含选自表1所示抗体的vh区序列的一个、两个或三个cdr(优选三个cdr)。在另一些实施方案中，本公开抗体包含选自表1所示抗体的vl区序列的一个、两个或三个cdr(优选三个cdr)。在一些实施方案中，本公开抗体包含表1所示抗体的6个cdr区序列。在一个优选实施方案中，抗体的cdr序列是表2所示的cdr序列。在一些实施方案中，本公开的抗rsv抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含(i)cdr1，其包含seq id no：1的氨基酸序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过5个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列，(ii)cdr2，其包含seq id no：2的氨基酸序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过5个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列，(iii)cdr3，其包含seq id no：3的氨基酸序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过5个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的所述序列，所述轻链可变区包含：(i)cdr1，其包含seq id no：4的氨基酸序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过5个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列，(ii)cdr2，其包含seq id no：5的氨基酸序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过2个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列，(iii)cdr3，其包含seq id no：6所示的氨基酸序列，或相对于所述序列含有一个或多个且不超过5个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的序列，其中包含修饰cdr的抗rsv抗体仍然具有结合rsv的能力。

7、在一些实施方案中，本公开的抗rsv抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含：(i)cdr1，其由seq id no：1的氨基酸序列组成，(ii)cdr2，其由seq id no：2的氨基酸序列组成，(iii)cdr3，其由seq id no：3的氨基酸序列组成，轻链可变区包含：(i)cdr1，其由seq id no：4的氨基酸序列组成，(ii)cdr2，其由seq id no：5的氨基酸序列组成，(iii)cdr3，其由seq id no：6所示的氨基酸序列组成。

8、在一些实施方案中，本公开的抗rsv抗体或其抗原结合片段包含重链可变区vh和/或轻链可变区vl，其中，

9、重链可变区：

10、1)包含与seq id no：7的氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者更高同一性的氨基酸序列或由上述序列组成，包含上述vh的抗rsv抗体具有结合rsv的能力；或

11、2)包含表2所示抗体的3个重链可变区cdr，且与seq id no：7的氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，包含上述vh的抗rsv抗体具有结合rsv的能力；或

12、3)包含与seq id no：7的氨基酸序列相比具有一个或多个取代(例如保守性取代)、插入或缺失的氨基酸序列，包含上述vh的抗rsv抗体具有结合rsv的能力；

13、上述轻链可变区：

14、1)包含与seq id no：8的氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者更高同一性的氨基酸序列或由上述序列组成，包含上述vl的抗rsv抗体具有结合rsv的能力；或

15、2)包含表2所示抗体的轻链可变区的3个cdr，且与seq id no：8的氨基酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，包含上述vl的抗rsv抗体具有结合rsv的能力；或

16、3)包含与seq id no：8的氨基酸序列相比具有一个或多个取代(例如保守性取代)、插入或缺失的氨基酸序列，包含上述vh的抗rsv抗体具有结合rsv的能力。

17、在优选的实施方案中，本公开的抗rsv抗体是抗rsv中和抗体或其抗原结合片段。

18、在一个优选实施方案中，本公开提供抗rsv中和抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区vh包含seq id no：7所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区vl包含seq id no：8所示的氨基酸序列或由其组成。

19、在一些实施方案中，本公开还涵盖抗f蛋白中和抗体的抗原结合片段，包括但不限于fv、fab、fab'、fab'-sh，f(ab’)2、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scfv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

20、在一些实施方案中，上述抗rsv中和抗体或其抗原结合片段还包含来自人抗体胚系共有序列的重链和/或轻链恒定区序列。上述的轻链恒定区优选是人源的κ或λ链恒定区。重链恒定区可以是γ、μ、α、δ、或ε链恒定区，在一些实施方案中，上述的重链恒定区是人源的igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2、igm、igd和ige同型。每个重链、轻链类型由具有本领域熟知的序列的特定恒定区来表征。

21、在一些实施方案中，恒定区优选是人igg恒定区，例如是人igg1、igg2、igg3或者igg4同型的恒定区。

22、优选地，本公开的单克隆抗体的轻链可以是κ型或λ型的。

23、在一个优选的实施方案中，轻链是λ型的。轻链可以是天然存在的链，包括天然重排的、经遗传修饰的或合成的轻链类型。

24、本公开的单克隆抗体的重链可以选自：同种型igm、iga、或igg，优选地igg。在一个优选的实施方案中，单克隆抗体的重链是igg型的。

25、应当理解，也可以使用这些恒定区结构域的序列变体，例如包含一个或多个氨基酸修饰，其中氨基酸位点是应kabat等人的(1991)eu索引系统标识。上述位点可以是选自234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、279、280、281、282d、283、284、285、286、287、288s、305、306、307、308、309、310、311、312、313、315、317、339、340、341、374、376、378、380、382、383、384、385、386、387、389、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、440和443。可选择的，fc区包括本领域技术人员已知的，在另外和/或替代位点的非天然存在的氨基酸残基(实例包括美国专利5,624,821；6,277,375；6,586,207；6,737,056；7,083,784；7,317,091；7,217,797；7,276,585；7,355,008；2002/0147311；2004/0002587；2005/0215768；2007/0135620；2007/0224188；2008/0089892；wo94/29351；wo99/58572；wo 98/48032；wo03/073238；wo05/35727a2；wo05/74524a2；j.w.chin等人，(2002)，journal of the americanchemical society 124：9026-9027；j.w.chin和p.g.schultz，(2002)，chembiochem 11：1135-1137；j.w.chin，等人，(2002)，picas united states of america 99：11020-11024；以及l.wang和p.g.schultz，(2002)，chem.1-10)。

26、在一些实施方案中，为了防止上述抗体的糖基化，例如在人igg恒定区进行修饰，这种修饰可以是n297a或n297q(sazinsky，pnas(2008)，105(51):20167-20172)。

27、在一些实施方案中，为了改变fc受体相互作用，例如在人igg恒定区进行修，这种修饰可以是l234a和/或l235e或l235a。

28、在一些实施方案中，为了防止或减少链交换，例如在人igg恒定区进行修饰，这种修饰可以是s228p(angal,s.mol immunol(1993)，30：105-108)。

29、在一些实施方案中，为了改变抗体依赖性细胞毒作用(adcc)，和/或补体依赖性细胞毒作用(cdc)，例如在人igg恒定区进行修饰，这种修饰是已知的(包括但不限于：natsume等人，cancer res(2008)，68(10):3863-72；idusogie等人，j.immunol(2001)，166(4):2571-5；moore等人，mabs(2010，2(2):181-189；lazar等人，pnas(2006)，103(11):4005-4010；shields等人，j.biol.chem.(2001)，276(9):6591-6604；stavenhagen.cancer res(2007)，67(18):8882-8890；alegre等人，j.immunol(1992)148:3461-3468.；kaneko，niwa等人biodrugs(2011)，25(1):1-11.)。

30、在一些实施方案中，还可以通过t366w修饰、和任选地进一步通过经由在相对的ch3结构域上的s354c和y349c修饰引入二硫键而诱导异源二聚体化(carter，journal ofimmunological methods(2001)，248:7-15.)。

31、在一些实施方案中，上述抗rsv中和抗体或其抗原结合片段特异性结合呼吸道合胞病毒(rsv)表面糖蛋白融合蛋白(f蛋白)，呼吸道合胞病毒(rsv)表面糖蛋白融合蛋白可以是呼吸道合胞病毒(rsv)表面糖蛋白融合蛋白的融合前构象蛋白(pre-f)。在一个优选的实施方案中，上述的中和抗体以不高于1×10-5m，例如1×10-6m、1×10-7m、1×10-8m、1×10-9m或1×10-10m或更小的kd与rsv pre-f蛋白结合。

32、特别地，本公开所提供的呼吸道合胞病毒的中和抗体，为人源抗体或人抗体或单结构域抗体。

33、第二方面，本公开基于前述研究成果，还提供了编码以上任何抗体或其片段的核酸分子。基于上述抗体分子的氨基酸序列，本领域技术人员根据本领域公知常识可以容易地获得本技术提供的核酸分子。在一个实施方案中，上述核酸分子包含由于密码子简并性而获得的核酸分子。

34、编码上述抗体的核酸分子可以是自种系或自b细胞中发生的重排衍生的天然存在的核酸，或者，核酸可以是合成的。合成的核酸还包括具有经修饰的核苷间键，包括硫代磷酸酯以提高核酸免于降解的抗性的核酸。核酸可以遗传工程化改造或者通过核苷酸合成完全合成生成。

35、在一个优选的实施方案中，本公开提供了包含至少一种编码本公开单克隆抗体的轻链的核酸和/或至少一种编码本公开单克隆抗体的重链的核酸的载体。核酸可以存在于同一载体中或者可以存在于不同的载体中。优选地，载体包含与核酸可操作连接的启动子以便于编码轻链和/或重链的核酸的表达。优选地，载体还包含用于在宿主细胞中复制和维持的起点。载体还可以包含位于编码轻链或重链的核酸的5’的编码信号序列的核苷酸序列。信号序列可以便于编码的肽链分泌入培养基中。

36、因此，应当理解的是，含有上述核酸分子的重组表达载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌等也属于本公开的保护范围。

37、在本领域中，已知许多原核和真核表达系统，其中真核宿主细胞诸如酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。优选地，哺乳动物细胞自hek293细胞、perc6细胞、cho细胞、cos细胞或hela细胞及其衍生物等。特别优选的是人源生产细胞系。

38、在一个优选的实施方案中，本公开的人单克隆抗体源自对rsv f蛋白(rsv pre-f和/或rsv post-f)具有高滴度的血浆样本的血液淋巴细胞，如此获得的人抗体对rsv具有高亲和力并具有中和作用，从而实现针对感染的有效保护。

39、本公开还提供了用于生成单克隆抗体的方法。在一个实施方案中，通过培养含有上述表达载体的宿主细胞来生成单克隆抗体。在一个实施方案中，生成的单克隆抗体被分泌入上清液中，并且可以通过常规的层析技术对其纯化。

40、在一个实施方案中，本公开提供由本公开的方法制备的抗rsv抗体或其抗原结合片段。

41、第三方面，本公开还提供了上述特异性结合rsv的抗体在如下a)～d)中至少一种中的应用：

42、a)制备特异性结合呼吸道合胞病毒的表面糖蛋白融合蛋白的产品；

43、b)制备特异性结合呼吸道合胞病毒抗原的产品；

44、c)制备预防、治疗或辅助治疗呼吸道合胞病毒的产品；

45、d)制备呼吸道合胞病毒疫苗。

46、作为优选，上述产品为药物。

47、作为一种优选的应用方案，本公开进一步提供一种预防、治疗或辅助治疗抗呼吸道合胞病毒感染的药物，其活性成分为本公开提供的抗rsv抗体或其抗原结合片段。

48、优选地，本公开提供的抗体可以与一种药学上可接受的载体配制为药物，并且可以通过本领域已知的多种方法来给予。给药途径和/或方式可以取决于所希望的结果而不同。

49、第五方面，本公开提供了包含本文提供的任何抗rsv抗体或其抗原结合片段的组合物，优选组合物为药物组合物。

50、在一个实施方案中，上述组合物还包含药用载体。在一个实施方案中，组合物中包含的抗rsv抗体及其抗原结合片段偶联至偶联部分。在一个实施方案中，该药物组合物进一步包含药学可接受载剂，赋形剂，或稀释剂。

51、第六方面，本公开提供了用于预防或治疗与rsv感染相关的疾病或病症的方法，包括向受试者施用预防有效量或治疗有效量的本公开的抗rsv抗体，或施用本公开的药物组合物。

52、本公开还涉及用于缓解或改善与rsv感染相关的症状的方法，包括向受试者给予有效量的本公开的抗rsv抗体，或施用本公开的药物组合物。

53、可以通过任何合适的途径进行施用，包括但不限于体表(topically)、肠胃外、局部或全身，例如鼻内、肌肉内、皮内、腹腔内、静脉内、皮下、口服施用，或者通过肺部施用。在一些实施方案中，通过雾化吸入器或吸入器施用本文所提供的药物组合物。可以将本文所提供的抗rsv抗体，或药物组合物施用于任何合适的对象，例如哺乳动物，例如人。

54、第七方面，本公开提供了检测对象或样品中rsv的方法，包括：(a)将对象或样品与本文提供的任何抗rsv抗体或其片段接触；和(b)检测抗rsv抗体或其片段和rsv间的复合物的形成。在一个优选实施方案中，本公开的抗rsv抗体及其抗原结合片段还包括可检测的标记。

55、第八方面，本公开涉及本文提供的任何抗rsv抗体或其片段在制备用于预防、治疗受试者中与rsv感染相关疾病或病症的药物或试剂盒中的用途。

56、在一个实施方案中，本公开提供了包含上述抗rsv抗体的组合物在制备用于预防、治疗受试者在与rsv感染相关的疾病或病症的药物或试剂盒中的用途。

57、第九方面，本公开提供了一种包含本公开的抗体或者组合物的试剂盒，例如诊断试剂盒，检测试剂盒，治疗试剂盒等。

58、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。