一种适用于H7亚型禽流感病毒的免疫组合物及其制备方法和应用

本发明涉及dna疫苗，具体地，涉及一种适用于h7亚型禽流感病毒的免疫组合物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、h7亚型禽流感宿主范围广，且部分毒株致病力强，严重威胁着家禽养殖业的健康发展。h7亚型禽流感的威胁持续存在主要是由于以下几点因素：(1)h7亚型禽流感病毒在世界各地均有发生，呈现出广泛传播与全球分布的特点；(2)虽然已经明确h7亚型禽流感在全球的传播与候鸟密切相关，但禽流感的传播机制仍不完全清晰；(3)aiv血清型众多，各个不同亚型病原之间存在重组变异，包括h7亚型在内的变异毒株随时可能会出现；(4)h7亚型禽流感对易感动物的致病性有所差异，存在隐性感染动物导致难以防控和根除。

2、h7亚型禽流感除了严重影响世界各国家禽养殖业的发展外，对人类的公共卫生也造成了极大的威胁。更重要的是，疫苗株与流行株抗原无法匹配造成免疫失败的现象不断发生，这促使着禽流感疫苗需要不断地更新换代。但是目前越来越多的h7n9亚型禽流感病毒在疫苗免疫压力下出现了位点漂移、点突变和基因重排等免疫逃逸现象，这也导致疫苗更新换代的频率加快，因此需要开发出与当前h7亚型aiv流行毒株抗原匹配的新型疫苗或提高疫苗的免疫能力，以降低h7亚型禽流感病毒的危害。

3、核酸疫苗作为新型疫苗中的热点研究对象，能够分为dna疫苗和rna疫苗。dna疫苗是第三次疫苗革命的代表，它是针对病原抗原蛋白基因构建重组质粒制备得到，但dna疫苗注射到动物肌肉内，肌细胞能够对质粒(外源基因)进行胞吞，质粒在细胞内表达和分泌相应的抗原蛋白，然后作为内源性抗原蛋白被树突状细胞摄取，进而通过mhc ii类分子抗原呈递途径，诱导cd4+t细胞分泌细胞因子，促使机体产生特异性体液免疫应答；同时抗原蛋白也能够激活b细胞诱导特异性体液免疫应答。此外，也可通过将含有抗原基因的dna疫苗重组质粒直接导入到树突状细胞内，然后在该细胞内“天然”地表达出抗原蛋白，进而通过mhc i类分子抗原呈递途径，诱导cd8+t细胞产生细胞免疫应答反应。因此，dna疫苗能够有效地活化b细胞和t细胞，诱导相应的体液免疫应答和细胞免疫应答。dna疫苗的优点包括：(1)不存在毒力反强或残留风险；(2)作为一种质粒能够在免疫动物体内自我复制与表达，抗原的长时间存在能够诱导机体产生良好的免疫反应，且副作用小；(3)重组质粒能够同时表达多个外源基因，具有开发多价疫苗的潜力；(4)dna疫苗制备过程安全，价格低廉，生产周期短且疫苗稳定，易于保存。

4、虽然目前dna疫苗的研制技术已取得很大的进步，但离实际推广应用仍然存在着距离，主要是由于其免疫原性弱和转染效率低等问题，进而导致接种动物后诱导的抗体水平有限，免疫效果差。从抗原角度来讲，提高dna疫苗免疫原性的首要方法是密码子优化，将dna疫苗的抗原基因按照免疫动物的密码子使用偏嗜性进行优化后，能够显著提高在被免疫动物内的蛋白表达水平。优化后的抗原基因制备得到的dna疫苗相较于未进行优化的抗原基因，在免疫动物体内的蛋白表达量能够提高5～20倍。

5、对于禽流感病毒而言，现有技术(doi：10.1371/journal.pone.0049952)公开了h5亚型禽流感dna疫苗与鸡mda5基因截短体mda5(1-483)联合免疫spf鸡之后，能够增强h5亚型禽流感dna疫苗的免疫想过，相较于单独使用h5亚型禽流感dna疫苗进行免疫，联合免疫后保护率从0％提升至16.67％；现有技术(张友.h5亚型禽流感dna疫苗及禽用免疫增强剂研制[d].华南农业大学,2018.)公开了保护率为72.73％的h5亚型禽流感dna疫苗与免疫增强剂联合免疫之后，保护率提升到了81.82％；现有技术(欧阳国文.h7亚型禽流感dna疫苗及其免疫佐剂的初步研究[d].华南农业大学,2017.)公开了优化后的h7亚型禽流感dna疫苗单独免疫spf鸡之后，其血清中hi滴度为4.8log2，保护率仅为50％。

6、可见针对禽流感病毒疫苗，即使对dna疫苗进行优化后，疫苗的保护率仅仅达到50％～70％，即使与免疫增效剂联用，其保护率也仅为80％左右，仍然存在着近20％的动物未被免疫。

7、因此，目前急需一种针对禽流感病毒且免疫保护率优异的禽流感疫苗产品。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种适用于h7亚型禽流感病毒的免疫组合物及其制备方法和应用。

2、本发明的第一目的是提供一种适用于h7亚型禽流感病毒的免疫组合物。

3、本发明的第二目的是提供上述免疫组合物在制备h7亚型禽流感病毒免疫产品中的应用。

4、本发明的第三目的是提供一种如上述免疫组合物的制备方法。

5、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

6、一种适用于h7亚型禽流感病毒的免疫组合物，所述免疫组合物包含h7亚型禽流感dna疫苗和免疫增强剂，所述免疫增强剂为含有核苷酸序列如seq id no：2所示的opchmda5截短基因的重组质粒。

7、其中，免疫增强剂能够表达核苷酸序列如seq id no：2所示的opchmda5截短基因。

8、优选地，所述核苷酸序列如seq id no：2所示的opchmda5基因位于重组质粒的ecor i位点和nhe i位点之间。

9、优选地，所述h7亚型禽流感dna疫苗为含有核苷酸序列如seq id no：4所示的opsf122haseq基因的质粒。

10、更优选地，所述核苷酸序列如seq id no：4所示的opsf122haseq基因位于质粒的sac i位点和nhe i位点之间。

11、优选地，所述重组质粒为pcaggk质粒；所述pcaggk质粒通过将pcaggs质粒中的氨苄抗性基因替换为卡那抗性基因制备得到。

12、将上述免疫组合物用于对spf鸡进行免疫时，针对h7亚型禽流感病毒感染，免疫保护率达到了91.67％；相较于单独使用疫苗(过表达核苷酸序列如seq id no：4所示的opsf122haseq基因的质粒)进行免疫时，免疫保护率提高了33％。

13、本发明还请求保护上述任一所述的免疫组合物在制备h7亚型禽流感病毒免疫产品中的应用。

14、优选地，所述h7亚型禽流感病毒免疫产品为h7亚型禽流感疫苗。

15、更优选地，所述h7亚型禽流感病毒为h7n9禽流感病毒。

16、本发明还请求保护一种如上述任一所述的免疫组合物的制备方法，包括以下步骤：

17、s1.合成核苷酸序列如seq id no：2所示的opchmda5基因；

18、s2.利用内切酶处理核苷酸序列如seq id no：2所示的opchmda5基因和质粒，得到酶切后的opchmda5基因和线性化的质粒；

19、s3.将步骤s2得到的酶切后的opchmda5基因和线性化的质粒利用dna连接酶进行连接，得到连接产物并转入感受态细胞中培养10～14h，培养结束后抽提质粒即为免疫增强剂；

20、s4.将步骤s3得到的免疫增强剂与h7亚型禽流感dna疫苗以质量比为1～3：1混合，即得免疫组合物。

21、优选地，步骤s2中所述质粒为pcaggk质粒；所述pcaggk质粒通过将pcaggs质粒中的氨苄抗性基因替换为卡那抗性基因制备得到。

22、优选地，步骤s4中所述免疫增强剂和h7亚型禽流感dna疫苗的质量比为1：1。

23、更优选地，步骤s4中所述h7亚型禽流感dna疫苗为含有核苷酸序列如seq id no：4所示的opsf122haseq基因的质粒。

24、其中，h7亚型禽流感dna疫苗能够表达核苷酸序列如seq id no：4所示的opsf122haseq基因。

25、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

26、本发明提供一种适用于h7亚型禽流感病毒的免疫组合物，所述免疫组合物包含h7亚型禽流感dna疫苗和免疫增强剂，所述免疫增强剂为含有核苷酸序列如seq id no：2所示的opchmda5截短基因的重组质粒。利用所述免疫组合物进行免疫时，能够诱导免疫动物体内产生强烈的免疫反应，刺激机体产生特异性抗体，对于禽流感病毒的免疫保护率能够达到91.67％，相较于单独使用h7亚型禽流感疫苗进行免疫时，免疫保护率提高了33％；本发明所述免疫组合物不仅能够显著提高dna疫苗的免疫原性，刺激机体产生更高免疫水平，且无毒副反应，生产成本低，生产周期短，适用于临床推广使用。