依米丁在制备治疗矽肺药物中的应用及实验方法

本发明涉及矽肺治疗药物，具体的是，涉及了依米丁在制备治疗矽肺药物中的应用及其实验方法。

背景技术：

1、矽肺是一种在全球范围内广泛存在的复杂职业疾病。其在新发职业病中占比高达90％。矽肺的发展进程可定义为四个阶段：正常阶段、炎症阶段、进展阶段和纤维化阶段。目前全球尚无临床特效药的治疗，大部分以对症治疗缓解病情为主要手段，其根本原因在于对尘肺发病机制及靶点的认知不足，是开发和研制新药收到限制。目前被广泛认可的发病机制是二氧化硅粉尘进入肺组织并被巨噬细胞吞噬，从而导致自身死亡并释放出二氧化硅被其他巨噬细胞所吞噬。巨噬细胞的逐渐死亡导致其他细胞溶酶体膜不稳定，溶酶体的破坏释放水解酶穿透细胞质，从而导致肺部实质细胞的受损，加速了矽肺的恶性发展。死亡后的巨噬细胞同时也会释放一系列的炎症因子，导致肺部损伤和炎症。最终，巨噬细胞的大量聚集促使受损组织中的成纤维细胞转化为肌纤维细胞，细胞外基质过度沉积，导致尘肺的纤维化。

2、尽管尘肺病和肺纤维化治疗方式众多，但目前的治疗手段非常有限。这些治疗方法包括药物和非药物治疗。其中，常见的治疗药物有克矽平、汉防己碱、磷酸羟基喹哌等。然而，这些药物早期治疗效果明显，但存在副作用大、后期效果不佳等缺陷。因此，寻找适合的尘肺病治疗药物是迫切需要的。

3、依米丁是一种既于原虫感染又用于诱导呕吐的药物，它是由吐根制成的一种异喹啉生物碱，于1894年从茜草科植物吐根中提取。十九世纪初科学家研究了依米汀的作用机制，被鉴定为一种寄生虫病有效药物，用于改善了阿米巴病的治疗。二十世纪，研究发现依米丁可以阻断真核细胞中的蛋白质合成，可用于细胞中蛋白质降解的研究。随着对依米丁的研究渗入，发现依米丁在抗肿瘤、抗菌、抗病毒方面都有具有显著药理作用。课题组的前期研究基础发现依米丁在治疗矽肺和肺纤维化上有着显著作用，因此在依米丁在药物治疗上有很大的开发价值，目前对于依米丁在肺纤维化上的药理活性研究较少，未见其发挥治疗肺纤维化及矽肺作用的相关报道。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明为了解决现有技术中的问题，而提出了一种依米丁在制备治疗矽肺药物中的应用及其实验方法。

2、本发明的技术方案是：本发明所述的依米丁在制备治疗矽肺药物中的应用，在所述的矽肺药物中含有依米丁组分。

3、进一步的，所述依米丁在制备治疗矽肺药物中应用的实验方法，其包括体内动物实验及体外细胞培养实验：

4、步骤(1)、体内动物实验，其具体实验步骤如下：

5、(1.1)、采用一次性二氧化硅鼻滴法将纳米级sio2混悬液滴进c57/bl雄性小鼠鼻中，建立矽肺肺纤维化动物模型；

6、(1.2)、动物分组时加入空白对照组a、加入二氧化硅组b、加入低浓度依米丁的治疗组c、加入高浓度依米丁的治疗组d、汉防己碱阳性对照组e；

7、(1.3)、从小鼠状态、肺部组织、细胞因子和分子水平观测依米丁对sio2诱导的小鼠肺纤维化的拮抗效应及作用机制；

8、步骤(2)、体外细胞培养实验，其具体实验步骤如下：

9、(2.1)、建立二氧化硅刺激模型及矽尘共培养模型，包括对照组及依米丁干预组；

10、(2.2)、观察依米丁对巨噬细胞活化、增殖、凋亡的影响，对上皮细胞和成纤维细胞纤维化的影响，测定各组巨噬细胞、上皮细胞及成纤维细胞il1-α、il1-β、il-6、tnf-α、tgf-β及细胞adra1a蛋白及mrna的表达。

11、进一步的，在步骤(1.1)中，所述建立矽肺肺纤维化动物模型具体步骤如下：

12、(1.1.1)、实验动物选择及分组：选择c57/bl雄性小鼠40只；

13、(1.1.2)、小鼠矽肺肺纤维化模型的建立：用无菌棉球沾取适量异丙醇，随后将小鼠与棉球放入同一空间使小鼠麻醉，待小鼠呼吸均匀后，取50μlsio2混悬液缓慢滴入小鼠鼻腔内，正常阴性对照组采用同样的方法滴入50μl无菌生理盐水；

14、(1.1.3)、小鼠矽肺肺纤维化药物模型的建立：用无菌棉球沾取适量异丙醇，随后将小鼠与棉球放入同一空间使小鼠麻醉，待小鼠呼吸均匀后，在依米丁低浓度组和高浓度组采用同样的方式进行sio2的鼻腔滴注，汉防己碱组采用同样的方法注入50μl sio2混悬液。

15、进一步的，在步骤(1.2)中，所述动物分组为，将40只小鼠随机分为5组：即为空白对照组a、加入二氧化硅组b、加入低浓度依米丁的治疗组c、加入高浓度依米丁的治疗组d、汉防己碱阳性对照组e每组8只；

16、其中，所述治疗组c中加入的低浓度依米丁的剂量为0.01mg/kg、治疗组d中高浓度依米丁的剂量为0.02mg/kg、对照组e中加入的汉防己碱剂量为10-15mg/kg。

17、进一步的，在步骤(1.3)中，所述从小鼠状态、肺部组织、细胞因子和分子水平观测依米丁对sio2诱导的小鼠肺纤维化的拮抗效应及作用机制具体方式是：

18、(1.3.1)、肺组织病理学检查：取左肺，经福尔马林固定，石蜡包埋，切片，做he染色，在光镜下观察肺组织病理变化；

19、(1.3.2)、肺组织纤维化评价：与步骤(1.3.1)同样操作，经福尔马林固定后包埋切片进行masson染色，在光镜下观察肺组织病理变化；

20、(1.3.3)、测定il1-α、il1-β、il-6、tnf-α、tgf-β炎性因子的表达：测定各组小鼠肺组织il1-α、il1-β、il-6、tnf-α、tgf-β炎性因子的表达水平；

21、(1.3.4)、adra1a、jak2、stat3测定：测定肺组织adra1a、jak2、stat3蛋白表达水平，检测adra1a分子表达水平。

22、进一步的，在步骤(1.3.3)中，所述测定各组小鼠肺组织il1-α、il1-β、il-6、tnf-α、tgf-β炎性因子的表达水平的测定方法为rt-pcr。

23、进一步的，在步骤(1.3.4)中，所述测定肺组织adra1a、jak2、stat3蛋白表达水平为western blot法，检测adra1a表达水平的测定方法为rt-pcr法。

24、进一步的，所述体内动物实验还包括给药方式：

25、即加入低浓度依米丁的治疗组c、加入高浓度依米丁的治疗组d、汉防己碱阳性对照组e中的动物均每日经腹腔注射给药一次，空白对照组a和二氧化硅组b腹腔给予等容积的生理盐水。

26、进一步的，在步骤(2.1)中，所述建立二氧化硅刺激模型及矽尘共培养模型的具体方式是：

27、(2.1.1)、二氧化硅刺激模型的建立：选取小鼠单核巨噬细胞raw264.7、人单核细胞thp-1建立二氧化硅刺激模型，将巨噬细胞分为4组：阴性对照组、二氧化硅实验组、依米丁实验组、汉防己碱实验组；

28、在实验组加入含sio2粉尘的悬液，终浓度为50μg/ml；在对照组仅加入含血清的培养基；四组均在37℃，5％co2条件下培养，且在培养时24小时后分别进行mrna提取，检测炎性因子il1-α、il1-β、il6、tnf-α、tgf-β及细胞adra1a因子表达，采用mtt法测定细胞活化情况，采用流式细胞仪中annexin v/pi双染色法测定细胞凋亡，rna-80℃保存备用；

29、(2.1.2)、矽尘共培养模型的建立：取巨噬细胞培养液，实验组加入含sio2粉尘的悬液，终浓度为50μg/ml；在37℃，5％co2条件下培养，培养24h，吸取培养上清液，-80℃保存备用，将矽尘巨噬细胞培养上清液作为培养基质添加至成纤维细胞中，建立矽尘共培养模型。

30、进一步的，在步骤(2.2)中，所述测定各组巨噬细胞、上皮细胞及成纤维细胞il1-α、il1-β、il-6、tnf-α、tgf-β及细胞adra1a蛋白及mrna的表达具体方式是：

31、(2.2.1)、上皮及成纤维细胞分组：将上皮及成纤维细胞细胞分为阴性对照组、二氧化硅实验组、依米丁实验组、汉防己碱实验组；加入含10％fbs-dmem培养基，均在37℃、5％co2的条件下培养；每组设立三次平行实验；

32、用rt-pcr法测定上皮细胞中il1-α、il1-β、il-6、tnf-α、tgf-β水平测定；在各组细胞培养24h后，收集细胞，采用western blot法检测蛋白表达水平；在各组细胞培养24h后，收集细胞，采用real time pcr法检测mrna表达水平；

33、(2.2.2)、i、iii型胶原的表达：各组成纤维细胞培养24h后，收集细胞，测定各组细胞i、iii型胶原的表达情况；

34、(2.2.3)、各组细胞rna中il1-α、il1-β、il-6、tnf-α、tgf-β水平测定：取p1中各组提取的rna，用rt-pcr法测定；

35、(2.2.4)、细胞adra1a、jak2、stat3蛋白的表达水平：各组细胞培养24h后，收集细胞，采用western blot法检测蛋白表达水平。

36、具体的：本发明的工作原理：1、该治疗矽肺药物的实验方法，在体内动物实验过程中，选择c57/bl雄性小鼠40只，将其随机分为5组，并分别为空白对照组a、加入二氧化硅组b、加入低浓度依米丁的治疗组c、加入高浓度依米丁的治疗组d、汉防己碱阳性对照组e每组8只；分组后，用异丁醇棉球将小鼠麻醉，经鼻腔滴入50μl sio2混悬液缓慢滴入，对照组采用同样的方法滴入50μl灭菌生理盐水；处理完成后，每天给各治疗组动物腹腔注射给药一次，矽肺模型组和正常阴性对照组给予等容积的生理盐水；在小鼠死亡后，将大量无菌生理盐水缓慢注入左心室内，观察肺部组织的颜色变化，待颜色由纯红色变为淡红色至浅白色，停止灌注；解剖后，取左肺，经福尔马林固定，石蜡包埋，切片，做he染色，在光镜下观察肺组织病理变化，观察肺组织masson染色，观察肺组织纤维化病变程度；使用免疫荧光化学法测定各组肺组织中巨噬细胞的表达情况；使用免疫荧光化学法测定各组肺组织中fam13a蛋白表达情况，rt-pcr法测定各组小鼠肺组织il1-α、il1-β、il-6、tnf-α、tgf-β炎性因子的表达水平，采用western blot法测定肺组织adra1a、jak2、stat3蛋白表达水平，rt-pcr法检测adra1a表达水平，测定完成后记录数据，观察依米丁给药后不同时间点各组小鼠体重变化及肺纤维化改变情况；

37、2、该治疗矽肺药物的实验方法，在体外细胞培养试验中，选取小鼠单核巨噬细胞raw264.7、人单核细胞thp-1；将巨噬细胞分为4组：阴性对照组、二氧化硅实验组、依米丁实验组、汉防己碱实验组。在实验组加入含sio2粉尘的悬液，终浓度为50μg/ml；在对照组仅加入含血清的培养基；四组均在37℃，5％co2条件下培养，且在培养时24小时后分别进行mrna提取，检测炎性因子il1-α、il1-β、il-6、tnf-α、tgf-β及细胞adra1a因子表达，采用mtt法测定细胞活化情况，采用流式细胞仪中annexin v/pi双染色法测定细胞凋亡，rna-80℃保存备用；

38、将二氧化硅刺激巨噬细胞后培养的上清液作为培养基质添加至上皮细胞beas-2b及成纤维细胞nih-3t3中，建立矽尘共培养模型；将上皮及成纤维细胞细胞分为空白对照组a、加入二氧化硅组b、加入低浓度依米丁的治疗组c、加入高浓度依米丁的治疗组d、汉防己碱阳性对照组e；加入含10％fbs-dmem培养基，均在37℃、5％co2的条件下培养；每组设立三次平行实验；用rt-pcr法测定上皮细胞中il1-α、il1-β、il-6、tnf-α、tgf-β水平测定；在各组细胞培养24h后，收集细胞，采用western blot法检测蛋白表达水平；在各组细胞培养24h后，收集细胞，采用real time pcr法检测mrna表达水平；

39、通过在上述体内动物实验中观测依米丁给药后不同时间点各组小鼠肺纤维化改变情况、观测依米丁给药后各组小鼠肺组织il1-α、il1-β、il-6、tnf-α、tgf-β炎性因子的表达水平、观测依米丁给药后各组小鼠肺组织巨噬细胞标志物f4/80以及小鼠呼吸功能指标fam13a的表达水平；

40、通过在上述体外细胞培养实验中观测各组巨噬细胞培养24h的il1-α、il1-β、il-6、tnf-α、tgf-β炎性因子的表达，观测各组巨噬细胞培养24h后的活化、增殖和凋亡情况、细胞adra1a蛋白及mrna表达水平；观测各组上皮细胞培养24h后il1-α、il1-β、il-6、tnf-α、tgf-β炎性因子的表达观测。各组成纤维细胞培养24后i、iii型胶原表达的情况。

41、本发明的有益效果是：本发明的特点是：依米丁能够有效地减缓矽肺纤维化的进程，降低矽肺肺组织中炎症反应及纤维化程度，并寻找到了新的肺部纤维化治疗靶点；此外，依米丁对其他肺纤维化疾病也具有一定的拮抗作用，因此可以被广泛应用于矽肺的药物治疗中。