DKK1在制备预防和/或治疗眼表上皮损伤疾病药物中的应用

本发明属于生物医药，尤其涉及一种dkk1在制备预防和/或治疗眼表上皮损伤疾病药物中的应用。

背景技术：

1、眼表上皮细胞是指位于眼表最前端的一层非角质化上皮细胞，包括角膜上皮和其毗邻的结膜上皮细胞。眼表上皮细胞在抵御外源性致病菌，维持眼表上皮和泪膜稳态，眼表正常生理功能以及眼表疾病损伤修复中都起着关键作用。眼表健康和视力的维持是基于角膜上皮、结膜上皮功能稳态以及泪膜稳定为前提，而角膜上皮和结膜上皮细胞的日常更新和损伤修复都依赖于各自的角膜缘上皮干细胞或结膜上皮干细胞。角膜缘上皮干细胞(limbal epithelial stem/progenitor cells，lsc)，是位于透明角膜和不透明巩膜交界的角膜缘上皮基底部的一群干细胞，也是维持角膜上皮完整性和自我更新的唯一干细胞来源。角膜上皮稳态是维持角膜透明性和完整性的关键因素，也是视力维持的先决条件。在角膜上皮细胞(corneal epithelial cells,cec)的日常更新和损伤修复过程中，lsc通过持续增殖分裂、迁移和分化，再生功能性角膜上皮，以维持角膜稳态和功能。当生理或病理情况下导致的lsc数量减少或者功能受损时，会延迟角膜上皮损伤修复的速度，无法有效再生功能性角膜上皮和恢复视力。角膜上皮的持续性缺损，会使得角膜无法提供稳定的眼表屏障功能，从而增加感染，同时还容易导致疾病向角膜深层进展，引发新生血管化或基质层瘢痕化等不必要的并发症。因此，研制维持lsc功能、促进角膜上皮损伤修复的相关药物对维持角膜正常稳态和加速上皮再生等具有重要意义。结膜上皮包括球结膜，穹窿部结膜和睑结膜，属于粘膜上皮，由非角质化的鳞状上皮和杯状细胞构成。结膜上皮细胞和杯状细胞都来源于结膜上皮干细胞(conjunctival epithelial stem/progenitor cells，cjecs)。结膜杯状细胞通过分泌黏蛋白(mucins)至泪液中，如分泌型黏蛋白muc5ac，以维持泪膜稳态。结膜上皮细胞分布于眼表巩膜上方和眼穹窿部和眼睑部位，起着保护眼表和减少眼部摩擦的作用。结膜上皮和角膜上皮都同时表达不同亚型的膜相关黏蛋白，如muc1，muc4和muc16等。这些膜相关黏蛋白锚定于眼表上皮表面，起到促进眼表泪液分布，保持眼表湿润和防止眼表泪液过度蒸发等作用。当cjecs数量减少或功能受损时，容易导致结膜稳态失衡和生理功能受损，从而造成干眼或炎症等。干眼是临床十分常见的眼表疾病，发病率在全世界约为5％-50％。因此，cjecs功能维持对于眼表健康也十分重要。

2、眼表上皮干细胞在眼表健康稳态和视力维持中起着关键作用，其功能包括：1)维持眼表上皮(角膜上皮和结膜上皮)日常更新和损伤修复。2)分布于眼表最外层，眼表上皮起着抵御外源性致病菌和保护内部眼球组织的功能。3)角膜上皮健康稳态维持是维持视力的基本条件之一，lsc则是维系角膜上皮稳态的唯一干细胞来源。4)结膜上皮健康稳态维持是保障眼表多种亚型黏蛋白分泌以及上皮完整性的关键，也是防止干眼或其他炎症疾病的重要因素，而cjecs则是维系结膜上皮健康稳态和损伤修复的干细胞来源。眼表上皮损伤修复延缓，常影响患者视力修复和眼表健康。目前眼表上皮损伤修复治疗方式和措施的具有一定的局限性，人工泪液、抗生素和抗病毒滴眼液等促进眼表损伤修复的原理是基于抑制眼表不利因素，使得上皮细胞能正常行使修复功能，其局限性在于疗效慢、愈合时间长，并且在眼表干细胞本身功能不足或数量缺乏的情况下，应用此类药物则疗效有限。贝复舒等含bfgf生长因子类药物，具有潜在的角膜血管增生及刺激成纤维细胞增生导致瘢痕化修复等问题。

3、dkk1(dickkopf-1)是经典wnt通路抑制剂，文献报道dkk1参与调控体内多种组织细胞增殖过程，但其调控具有组织特异性，不同组织之间可能呈现完全相反的调控功能。例如，文献《dickkopf-1contributes to hepatocellular carcinoma tumorigenesis byactivating the wnt/beta-catenin signaling pathway》报道了dkk1促进肝癌细胞增殖。但文献《zbtb38 suppresses prostate cancer cell proliferation and migration viadirectly promoting dkk1 expression》则指出dkk1发挥抑制前列腺癌细胞增殖的功能。此外，《the dkk1 dose is critical for eye development》文献报道也指出dkk1在眼发育调控中具有重要作用，其异位表达可导致严重的眼发育缺陷。但关于dkk1对眼表上皮干细胞(包括lsc和cjecs)的增殖调控以及眼表上皮损伤修复作用目前尚未有明确报道，仍有待进一步的研究。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种dkk1在制备预防和/或治疗眼表上皮损伤疾病药物中的应用。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：如下i)-v)中的至少一种在制备预防和/或治疗眼表上皮损伤疾病药物中的应用；

3、i)、dkk1蛋白；

4、ii)、在dkk1蛋白的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，且与dkk1具有相同或相似功能的蛋白；

5、iii)、编码i)或ii)所述蛋白的核酸分子；

6、iv)、在iii)的所述核酸分子的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同或相似功能蛋白的核酸分子；

7、v)、能够调控i)-v)中的至少一种的水平或活性的物质。

8、本技术发明人经过前期的深入研究，首次发现，fasciculation and elongationprotein zeta 1(fez1)通过靶向dkk1，调控lsc细胞增殖和抑制lsc细胞衰老，对维持角膜上皮细胞健康状态和增殖能力起到关键作用；此外，本技术发明人也首次发现，dkk1重组蛋白对cjecs增殖同样具有促进作用，在cjecs体外培养过程中，添加dkk1重组蛋白可有效提高细小致密的干细胞团簇扩增比例、促进细胞增殖；因此本发明提供的i)-v)中的至少一种可应用于制备预防和/或治疗眼表上皮损伤疾病药物。

9、优选地，所述dkk1蛋白选自眼表干细胞内源性表达的dkk1蛋白或dkk1外源性重组蛋白中的至少一种。

10、优选地，所述编码i)或ii)所述蛋白的核酸分子包括编码dkk1蛋白或在dkk1蛋白的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，且与dkk1具有相同或相似功能的蛋白的基因组dna、cdna、重组dna或mrna、hnrna；或者与上述dna、cdna、重组dna或mrna呈反向互补的核酸分子。更优选地，所述核酸分子可根据实际需要进行修饰或优化，从而使基因表达更高效。

11、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述眼表上皮损伤疾病为生理或病理原因导致的眼表干细胞增殖能力受损及损伤修复延迟。

12、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述眼表上皮损伤疾病包括(a)-(c)中的至少一种：

13、(a)生理性干细胞增殖能力受损；

14、(b)机械性损伤、感染、炎症或化学性损伤所致的眼表上皮损伤；

15、(c)慢性疾病合并眼表上皮修复延迟。

16、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述慢性疾病包括糖尿病。

17、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述眼表干细胞为角膜缘上皮干细胞(lsc)和/或结膜上皮干细胞(cjecs)。

18、另外，本发明还提供了一种预防和/或治疗眼表上皮损伤疾病的药物制剂，包括如下i)-vi)中的至少一种：

19、i)、dkk1蛋白或编码dkk1蛋白的核酸分子；

20、ii)、包含编码dkk1蛋白的核酸的表达载体；

21、iii)、含有ii)的重组宿主；

22、iv)、增强dkk1基因表达的启动子或增强子；

23、v)、促进dkk1基因表达的诱导剂；

24、vi)、提高dkk1蛋白活性的制剂。

25、本发明提供的预防和/或治疗眼表上皮损伤疾病的药物制剂中的dkk1基因和其蛋白是正常眼表上皮干细胞表达的内源性蛋白，在眼表疾病治疗应用中不会引发异物免疫排斥等问题，具有安全性。所述外源性dkk1蛋白目前已成功商用，可通过生物公司采购，产品成分明确、质量稳定。并且本发明实验证实dkk1基因和其蛋白在小鼠角膜上皮损伤模型中大量上调表达，应用dkk1重组蛋白能显著促进角膜上皮修复速度，表明本发明所述dkk1基因和其蛋白具有明确的有效性和无明显药物毒副作用。同时，dkk1还是分泌蛋白，在后续临床转化应用方面极具便利性。

26、优选地，所述表达载体包括腺病毒、慢病毒中的任意一种。

27、优选地，所述宿主包括细胞。

28、作为本发明所述药物制剂的优选实施方式，所述药物制剂为任意眼表临床用药适用剂型的至少一种，所述眼表临床用药适用剂型包括片剂、缓释片剂、眼膏剂、凝胶剂、注射剂、溶液剂、滴眼剂、气雾剂、喷雾剂。

29、作为本发明所述药物制剂的优选实施方式，所述给药方式包括结膜下植入给药、结膜下注射给药、眼表涂布给药、眼表直接给药中的至少一种。如若为片剂或缓释片剂则可为结膜下植入给药，若为眼膏剂或凝胶剂则可为眼表涂布给药，若为注射剂或溶液剂则可为结膜下注射给药，若为滴眼剂、气雾剂或喷雾剂则可为眼表直接给药。

30、优选地，所述给药方式为眼表直接给药。

31、作为本发明所述药物制剂的优选实施方式，当应用对象为人时，所述单次给药有效浓度为30-150ng/ml；当应用对象为其他动物时，所述单次给药有效浓度为5-20ng/ul。

32、优选地，当应用对象为人时，所述单次给药有效浓度为为50-100ng/ml，更优选为80-100ng/ml。

33、优选地，当应用对象为其他动物时，所述单次给药有效浓度为10-15ng/ul。

34、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

35、本发明首次发现，dkk1在维持眼表干细胞增殖能力和健康状态上具有关键作用，抑制dkk1表达可造成眼表干细胞增殖能力下调和呈现细胞衰老表型。dkk1重组蛋白可以促进眼表干细胞形成干细胞增殖团簇、提升干细胞增殖能力、保持细胞健康稳态，同时动物实验也验证了dkk1可加速角膜上皮损伤修复速度。此外，因dkk1是生理条件下眼表上皮干细胞也表达的内源性蛋白，因此在眼表干细胞体外研究或体内治疗应用中并无明显的药物毒性，说明dkk1蛋白可以安全并且有效的应用于眼表上皮损伤相关疾病的治疗。同时，dkk1是分泌蛋白，相较于以往文献报道的转录因子或膜蛋白等，dkk1分泌蛋白的优势在于其能更加便利的被加工和转化应用于后续临床治疗中，如制备成注射针剂或者是滴眼液等。因此，dkk1基于其安全性、有效性和便利性等特点，在后续临床转化应用于生理性或病理性导致的眼表上皮损伤修复缓慢的相关疾病治疗中具有显著优势，能够用于制备预防和/或治疗眼表上皮损伤疾病的药物制剂，其应用或制成的药物制剂可能成为临床治疗药物的较优选项。