二甲双胍在制备年龄相关性白内障药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药，尤其涉及二甲双胍在制备年龄相关性白内障药物中的用途。

背景技术：

1、晶状体的混浊称为白内障，白内障是目前在临床中最为常见的眼病，世卫组织估计，全世界有1.8亿视力障碍者，其中46％是由白内障引起的，其中以老年性白内障最为多见，70岁以上的老人，患病率可达100％。由于人口的增长和老龄化，全世界的失明负担不断增加。白内障的患病率与年龄呈正相关。随着人口老龄化的加剧，年龄相关性白内障(agerelated cataract，arc)的患病率逐年增加，不仅严重影响患者的健康和生活质量，而且造成巨大的经济和社会负担。

2、白内障需要得到及时治疗，延误治疗会带来青光眼、葡萄膜炎等严重的眼部并发症，并且长期的视力低下会引起患者严重的心理问题。目前尚没有明确可以延缓白内障发生的药物，手术是唯一且有效的治疗方法。但目前中国的白内障手术率处于一个低位。究其原因，有以下三个方面：

3、从技术角度来说，首先，虽然近年来白内障手术在技术上取得了很大的发展，但毕竟是一种创伤性治疗方案，面临着各种可能出现的手术并发症，如感染、角膜散光、角膜水肿、虹膜损伤、悬韧带损伤、青光眼、后发性白内障，这些并发症将带来严重的风险，影响术后视力，有些患者甚至需要进行再次手术。其次，植入的人工晶状体无论技术多么先进，仍然无法与人体本身的晶状体相媲美。第三，大部分患者在手术期间会表现明显的心理障碍。

4、从卫生经济学角度来说，手术治疗会给患者带来一定的经济压力，且由于患者群体巨大，手术费用较高，对社会造成了严重的经济负担。

5、从医疗资源可及性来看，由于医疗条件的局限，不均衡的医疗资源分布，一些白内障患者因未能得到及时、安全有效的治疗，从而导致失明。

6、因此，有效的白内障相关预防和治疗药物研发具有重要意义。对于老年性白内障，市面上一些药物宣称可以抑制白内障的产生以及进展，但缺少真正有实际意义的临床证据，这些药物不但不能解决疾病的进展，反而产生信息误导，严重拖延患者就诊时间，延误病情。就实际情况而言，目前尚无明确的药物可以预防、治疗白内障。

7、二甲双胍(metfromin，met)是世界范围内治疗2型糖尿病最广泛的口服降糖药，在临床应用中有超过60年的优良安全记录。二甲双胍公认的作用机制为激活ampk(adenosine5‘-monophosphate(amp)-activated protein kinase)通路。ampk是生物能量代谢调节的关键分子，ampk的激活增加了分解代谢(atp生成)途径的速率，并降低了合成代谢(atp利用)途径的速率。除了维持细胞内能量平衡外，ampk还调节全身能量代谢。鉴于其在控制能量稳态中的关键作用，ampk作为潜在的治疗靶点已引起广泛关注。在衰老的皮肤组织中，ampk通路被抑制，皮肤的血管系统受损，愈合能力降低。二甲双胍可通过激活ampk增强衰老皮肤组织的愈合能力，改善了伤口床的细胞活力。此外，据报道，二甲双胍通过激活ampk，延迟血管内皮哀老，长期低剂量服用二甲双胍可显著减轻血管老化，并抑制年龄相关性动脉粥样硬化斑块的形成。

技术实现思路

1、本发明提供了制造一种以二甲双胍在晶状体囊膜组织内干预特定基因表达的药物的技术方案，包括二甲双胍在制备预防及/或治疗年龄相关性白内障药品中的用途，解决了背景技术中指出的现有技术难题，并进一步提出了met的有效安全服用剂量和有效的服用年龄相关的技术方案。

2、本发明涉及的arc的预防剂及/或治疗剂采用简便、无侵袭的经口施予方式，患者可主动进行自我管理，使白内障的预防效果或治疗效果更迅速体现。

3、本发明涉及的arc的预防剂及/或治疗剂被施予至受试个体，所述受试个体为人类以外的动物，作为上述人类以外的动物的例子，可举出啮齿动物大鼠、小鼠及哺乳动物猪、犬等。发明人通过无干预、自然衰老的方式制备arc动物模型，完全遵循动物的自然衰老过程，有效避免人为干预制备的急性衰老模型的复杂影响因素，以保证数据的真实模拟性。

4、二甲双胍作为经典口服降糖药物有着极高的安全性，副作用小，不易刺激其他器官。本发明所用药物盐酸二甲双胍片(商品名：格华止)购于中美上海施贵宝制药有限公司。

5、一、不同起始服用年龄下met对晶状体囊膜组织的影响以及白内障发生发展的研究

6、各种应用方案中，以正常小鼠能活130周(相当于人的寿命85岁)计算；分别在c57bl/6j小鼠45周、61周、76周和100周(相当于人的30岁、40岁、50岁和65岁)给予0.1％的met，并设置自然年龄鼠16只接受标准的纯化小鼠饮食和随意饮水，8周龄青年组(young)小鼠20只饲养至3个月，自由进食普通饲料。服药后每20周观察小鼠白内障发生情况，即晶状体囊膜混浊比例及衰老相关指标表达，以此量化分析met治疗年龄相关性白内障有效的起始治疗年龄。

7、二、met服用剂量对晶状体囊膜组织的影响以及白内障发生发展的研究

8、发明人将met创新性地应用于各种arc模型中，长期、低剂量经食物给予met。各种应用方案中，发明人将met混合于饲料中，以获得含有0.02％、0.1％、0.2％、0.5％met的饲料，并在小鼠76周龄时给予喂食。自然年龄组接受标准的纯化小鼠饮食和随意饮水，观察动物进食情况。在小鼠在服用30周后观察晶状体囊膜混浊比例及衰老相关指标，统计分析得到有效的有效安全的治疗浓度，根据动物进食量计算出动物met使用量，再按照体表面积换算方式推算出人体等效剂量人体等效剂量(hed)。

9、人体等效计量计算过程如下：以met浓度为0.1％，动物进食量为2g/日为例，动物进食量为2g/日，其中含0.1％的met，即met的给药剂量约为2mg/日。动物体重20g，则每日单位体重药量为2mg/0.02kg＝100mg/kg，根据体表面积推算成人体等效计量为100x(0.02/60)^0.33＝7.13mg/kg，成人标准体重按60kg计，每日药量为7.13x60＝427.8mg。其他不变，当met浓度为0.5％，则推算成人体等效计量为35.61mg/kg，一位体重为60kg的成人每日药量为2136mg。发明人选择安全系数为10，即人体等效计量为427.8/10＝42.78mg/日标准体重60kg成人。二甲双胍剂量范围可以为1-2000mg/日标准体重60kg成人，其中以40-200mg/||标准体重60kg成人最为优选。

10、需要说明的是，以下实施方案中未具体描述的实验方法，均按照《生物化学实验技术》或者《cold spring harbor protocols》所记载的常规生化实验方法或者在商用试剂供应商所建议的实验操作下进行。

11、将相当于人类30-50岁的受试个体随机分为自然衰老(aged)组和met组，aged组正常饲养；met组受试个体施予无菌二甲双胍饲料。饲养结束后，将受试个体处死，用眼科剪镊摘除眼球，完整分离晶状体，用显微镊剥离晶状体囊膜，放入无菌ep管中，液氮或者-80℃冰箱中储存，用于后续分析。另取晶状体，对晶状体浑浊度进行分析后，多聚甲醛固定。

12、晶状体混浊度分析

13、对受试个体的晶状体进行拍照，图像导入图像处理软件(image j)，对像素数进行分析，由此分别算出晶状体整体的面积及白浊部的面积。

14、晶状体的混浊比例(％)＝100×{(晶状体的混浊部面积)/(晶状体整体的面积)}。

15、为验证met对延缓晶状体上皮细胞衰老的作用及其作用机制，发明人分析了met对衰老的晶状体囊膜组织中ampk通路的激活作用。发明人还检测了met对衰老的晶状体囊膜组织中自噬标志性基因lc3和p62表达的影响。发明人对受试个体的晶状体组织进行石蜡包埋、组织切片、he染色观察晶状体上皮细胞形态，采用免疫组织化学染色检测衰老标志性基因p21、p53在各组受试个体晶体上皮组织中的表达差异，分离晶状体囊膜组织，提取晶状体囊膜的组织总蛋白进行了western blot检测，以进一步验证衰老标志性基因的表达情况。

16、石蜡包埋

17、(1)将获取的小鼠晶状体标本在多聚甲醛中固定48h以上；

18、(2)组织样本放入包埋盒中，用铅笔表明样本名称、编号、日期，将所有包埋盒用铜线串好；

19、(3)脱水：将包有样本的包埋盒置于75％乙醇中5h，95％乙醇i中过夜；

20、(4)脱水：第二天，将包埋盒置于95％乙醇ii中1h，无水乙醇i中1h，无水乙醇ii中1h；

21、(5)提前2h打开包埋机预热，将蜡全部融化，蜡嘴75℃，左蜡缸和右蜡缸均为60℃；

22、(6)组织样本透明：样本于二甲苯i中10分钟，二甲苯ii中10分钟；

23、(7)组织样本浸蜡：样本于左蜡缸中1.5h，右蜡缸中1.5h；

24、(8)组织样本包埋：将组织放入盛有石蜡的模具中，摆好位置，于石蜡包埋机的冷却台上冷却，蜡凝固后取下模具，存于-20℃。

25、组织切片

26、(1)蜡块存于-20℃2h以上可用于组织切片。

27、(2)配制30％乙醇200ml，漂片仪加1.5l蒸馏水，加热至39℃；

28、(3)将蜡块放置在切片机上，调整蜡块倾斜角度，并将切片厚度调至4μm；

29、(4)将蜡片先置于30％乙醇中，再放入漂片仪中展片，用载玻片捞起显微镜下观察，直至切到含有lecs的完整组织；

30、(5)将切片置于载玻片盒中，室温存放。

31、苏木素伊红染色(he)

32、(1)脱蜡：选取组织完整的样本，放在玻片架上，于60℃烘箱中放置2h，烘烤完成后，将切片迅速置于二甲苯i涮一下，二甲苯ii中30分钟；

33、(2)水化：将切片置于无水乙醇i中5分钟，无水乙醇ii中5分钟，95％乙醇i中5分钟，95％乙醇ii中5分钟，75％乙醇中5分钟，蒸馏水中5分钟；

34、(3)水化后用苏木素染色液对切片染色8分钟，然后再用自来水冲洗10分钟，最后放在蒸馏水中洗数秒钟；

35、(4)用伊红染色液对切片再次染色3分钟，然后放在自来水下冲洗2分钟；

36、(5)梯度脱水：将切片于70％乙醇中5分钟，85％乙醇中5分钟，95％乙醇中5分钟，无水乙醇i中5分钟，无水乙醇ii中5分钟；

37、(6)透明：将切片于二甲苯i中5分钟，二甲苯ii中5分钟；

38、(7)封片：用中性树脂胶封片，待树脂胶完全凝固后显微镜观察。

39、免疫组织化学染色(ihc)

40、(1)脱蜡：选取组织完整的样本，放在玻片架上，于60℃烘箱中放置2h；

41、(2)脱蜡：烘烤完成后，将切片迅速置于二甲苯i涮一下，二甲苯ii中30分钟；

42、(3)水化：将切片置于无水乙醇i中5分钟，无水乙醇ii中5分钟，95％乙醇i中5分钟，95％乙醇ii中5分钟，75％乙醇中5分钟，蒸馏水中5分钟。

43、(4)抗原修复：将柠檬酸盐修复液装入瓷缸中，然后将瓷缸放在锅中，置于电磁炉上煮沸，将水化完成的切片置放入沸腾的修复液中，盖好盖子，火锅模式，1000w煮30分钟，修复完成后，关闭电磁炉，打开盖子，自然冷却至室温；

44、(5)灭活内源性过氧化物酶：冷却完成后，将组化架从修复缓冲液中轻轻取出，置入另一装有pbs缓冲液的组化盒内，摇床震荡清洗(摇床速度不能太快，以组化盒内液面震荡摆动为宜，太快易使片子脱落)，清洗5分钟，重复3次；

45、(6)用组化笔沿组织切片周边，划线圈住组织所在区域，划线距离组织5mm左右(太远会浪费抗体，太近易造成边缘效应)

46、(7)将切片置于孵育盒内(盒内加入适量水分保持湿度)，将3％h2o2滴加在组织切片上，分布于整个圈住区域，避光孵育10分钟。

47、(8)封闭：孵育完成后，将切片重新置于切片架上，用pbs于组化盒内振洗5分钟，重复3次，将切片置于孵育盒内，5％bsa均匀滴加于组织切片上，分布于整个圈住区域，室温30分钟；

48、(9)一抗孵育：用pbs稀释一抗至工作浓度，将一抗滴加在切片上，将切片放置于孵育盒，盖好盖子，置于4℃孵育过夜。

49、(10)将孵育盒拿出置室温复温30分钟，pbs振洗5分钟，重复3次；

50、(11)二抗孵育：将切片置于孵育盒内，将二抗滴加在组织片上(兔二步法试剂盒pv6001，鼠二步法试剂盒pv6002)，置于37℃温箱中孵育30分钟；

51、(12)配制dab显色液，二抗孵育完成后，pbs振洗5分钟，重复3次；

52、(13)将dab显色液滴加在切片上，于显微镜下观察样本的显色情况，显色深度合适后，将切片置于备好的清水中，终止显色，记录所需显色时间，控制同一批样本的显色时间一致；

53、(14)梯度脱水：将切片于70％乙醇中5分钟，85％乙醇中5分钟，95％乙醇中5分钟，无水乙醇i中5分钟，无水乙醇ii中5分钟；

54、(15)透明：将切片于二甲苯i中5分钟，二甲苯ii中5分钟；

55、(16)封片：用中性树脂胶封片，待树脂胶完全凝固后显微镜观察。

56、组织总蛋白提取

57、(1)从液氮或-80℃中取出小鼠晶状体囊膜组织，放于1.5ml无菌ep管中用显微剪尽可能剪碎，ep管置于冰上；

58、(2)ep管中加入适量的裂解液，漩涡震荡1分钟，冰上静止5分钟，重复4次；

59、(3)配制bca工作液，将蛋白标准、pbs、蛋白样品按照说明书配制好，加入96孔板中，再加入bca工作液，于37℃温箱中静置30分钟；

60、(4)拿掉96孔板盖子，将96孔板放入酶标仪中，检测各孔a562的吸光度值，根据数值绘制标准曲线；

61、(5)将蛋白样品吸光度值带入公式，算出样本蛋白浓度，并将浓度调成一致；

62、(6)按蛋白裂解液/4的比例加入5×loading buffer，旋涡震荡4分钟，用封口膜封口，置于开水中煮10分钟；

63、(7)将煮后的蛋白样品，除去封口膜，4℃离心(14000rpm，8分钟)；

64、(8)离心后，收取上清，并标记浓度、时间和分组，保存于-20℃。

65、本发明采用graphpad prism7.0对sa-β-gal染色、qrt-pcr、western blot结果制图，采用students＇t检验及单因素或多因素方差分析(均值±标准差)，计算p值，以p＜0.05为有统计学意义。

66、实验结果显示，与衰老的小鼠晶状体囊膜组织相比，met组小鼠晶状体囊膜组织ampk通路的关键基因p-ampk和pacc呈现高表达，met组小鼠晶状体囊膜组织中自噬标志性基因lc3和p62呈现低表达。综上，本发明提供了二甲双胍用于制造可在晶状体囊膜组织中降低自噬标志性基因lc3和p62表达，同时提升ampk通路的关键基因p-ampk和pacc表达的药物的用途以及二甲双胍在制备防治年龄相关性白内障药物中的应用的技术方案。发明人将二甲双胍创新性地应用于arc的干预治疗，验证了二甲双胍可通过激活衰老晶状体上皮细胞中的ampk通路，恢复自噬通量，延缓晶状体上皮细胞的衰老的机制。本发明提出，二甲双胍的有效剂量范围为1～2000mg/日标准体重60kg成人，自30岁～50岁开始用药，用药期限可一直持续到老年。

67、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：二甲双胍作为临床2型糖尿病治疗一线药物，本发明的新用途能够抑制晶状体上皮细胞衰老，延缓年龄相关性白内障的发生发展进程，是目前首个经过药理学和药效学验证的、能够明确延缓白内障发生与发展的药物，对白内障预防和治疗具有非显而易见的有益效果。本发明填补了临床上没有有效的白内障防治药品的空白，与手术相比创伤小，应用方便，临床应用面广。二甲双胍有望成为预防及/或治疗年龄相关性白内障的新靶点。本发明对进一步研发白内障防治药品具有重要的实际意义。

68、本发明能够用于年龄相关性白内障的预防剂及/或治疗剂的开发。本发明所述预防剂及/或治疗剂应用简便、安全、无创伤，能够有效的预防及/或治疗年龄相关性白内障的发生，解决当前白内障手术治疗的技术缺陷和现有药品临床疗效不佳的问题，满足老年患者的临床需求，尤其是偏远地区患者。