一种与载体蛋白质共价结合的多组分壁磷壁酸多糖的缀合物

本发明涉及一种与载体蛋白质共价结合的多组分壁磷壁酸多糖的缀合物，属于医药。

背景技术：

1、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus,简称金葡菌)隶属于葡萄球菌属(staphylococcus)，有“嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表。金葡菌是常见的人和动物机会致病菌，可定植于多种组织和器官中。在人类中，鼻子是最常见的定植位点。大约20-30％的健康人群持续存在着金葡菌，还有约30％的人群间歇性的携带金葡菌。鼻金葡菌定植化是社区和医院存在金葡菌感染的重要原因。金葡菌感染可引起多种疾病，包括：(1)皮肤和软组织感染，如疖病；(2)危及生命的感染，如肺炎和菌血症；(3)严重的并发症，如心内膜炎、脓毒性关节炎和骨髓炎。感染金葡菌的住院患者延长了住院时间，并增加了抗生素的使用量，提高了发病率、死亡率和治疗成本。

2、感染金葡菌后，通常可选用红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素或先锋霉素vi治疗，但由于抗生素的滥用，出现多种耐受抗生素的新菌株，特别是耐甲氧西林金葡菌菌株(methicillin-resistant s.aureus,mrsa)的迅速蔓延使得单纯依靠抗生素治疗金葡菌引发的相关疾病变得越来越不可靠。mrsa导致的感染用抗生素疗法很难治愈且致死率高。因此，针对金葡菌疫苗的研发已广泛开展，虽然许多疫苗已经进入临床研究阶段，但目前还没有一款可以预防或治疗金葡菌感染的疫苗上市。

3、近年来，研究表明金葡菌表面的壁磷壁酸(wall teichoic acid，wta)具有特异性的化学结构，是抗金葡菌疫苗开发的有效靶点。金葡菌wta的主链由多聚1,5核糖磷酸酯(1,5-d-ribitol phosphate,rbop)重复单元组成，核糖醇上的羟基可以被d-丙氨酸和n-乙酰d葡糖氨基糖基选择性的修饰。目前，发现了三种n-乙酰d葡糖氨基糖基转移酶，tars酶在c-4修饰β构型n-乙酰d葡糖氨基(β-1,4-glcnac),tarm酶在c-4修饰α构型n-乙酰d葡糖氨基(α-1,4-glcnac)，tarp酶在c-3修饰β构型n-乙酰d葡糖氨基(β-1,3-glcnac)。近年来，人们已经化学合成了了单一糖基化构型修饰的wta并制备成糖蛋白疫苗，通过动物实验表明这些疫苗可以诱导小鼠产生较高水平滴度的特异性igg抗体。然而不同金葡菌菌株表达不同糖基化修饰构型的wta，多种构型wta组分的寡糖疫苗成为了新的方向。此外，天然提取的wta存在均一性较差，质量难以控制的问题；而化学合成wta存在合成步骤长、收率低等问题。

4、针对上述目前方法存在的问题，有必要寻求一种通过化学-酶法结合的方法，以合成多种构型的wta。通过更简便的方法，得到多种构型的wta，并进一步制备成糖蛋白结合疫苗从而应用于预防或治疗金葡菌的感染。

5、目前多组分寡糖疫苗的生产流程一般都是各单独组分寡糖与载体缀合后再通过一定的比例混合制备而成。这种类似鸡尾酒似的寡糖多组分疫苗需要多次与载体连接，经多次纯化，还需要按比例混合，增加了生产步骤，也不利于产品质量的控制。寻找一种新颖的多组分糖蛋白结合疫苗生产方法是大有脾益的。

技术实现思路

1、基于以上背景和当前技术难点，本发明基于wta的三种糖基化修饰构型设计了化学-酶法结合的方法，合成了多种构型的wta，并将合成的多组分壁磷壁酸多糖作为寡糖半抗原，与具有免疫原性的载体蛋白共价偶联制备得到的缀合物，可作为糖缀合疫苗。经验证，该方法制备的糖缀合疫苗具有较强的免疫原性，能诱导机体产生高滴度和多样的t细胞依赖的特异性igg抗体。值得注意的是，本发明得到的单个wta分子可以同时修饰多种糖基化构型，并通过进一步制备成寡糖疫苗，该新颖的多组分疫苗免疫产生的抗体可以识别含有不同wta构型的金葡菌。这克服了目前金葡菌wta结构多样性导致的疫苗普适性、制备和质量控制困难等问题。

2、为实现上述的技术目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一个方面，提供了一种与载体蛋白质共价结合的多组分壁磷壁酸多糖的缀合物，所述多组分壁磷壁酸多糖缀合物包含1,5核糖醇磷酸酯的重复单元，其中部分所述核糖醇残基在3或4位被n-乙酰基d-葡糖氨基残基取代，且每个壁磷壁酸多糖分子均同时含有端基异构体构型为α和β的n-乙酰基d-葡糖氨基残基，所述多组分壁磷壁酸多糖与载体蛋白质共价结合形成所述缀合物，其中所述载体蛋白质向缀合物提供至少一个被t辅助淋巴细胞识别的表位。

4、可选的，在本发明的一种实施方式中，所述载体蛋白质包含至少一个t辅助表位的氨基酸链。

5、可选的，在本发明的一种实施方式中，所述壁磷壁酸多糖同时具有两种以上所述重复单元：

6、

7、可选的，在本发明的一种实施方式中，所述壁磷壁酸多糖是通过化学酶法合成得到的，具体包括以下步骤：核糖醇-5-磷酸酯多聚物、糖供体与三种金黄色葡萄球菌壁磷壁酸n-乙酰d葡糖氨基糖基转移酶tars,tarm和tarp其中至少两种，合成具有两种以上n-乙酰基d-葡糖胺基残基构型的金黄色葡萄球菌壁磷壁酸。

8、本发明方法包括tars,tarm和tarp三种酶其中任意两种糖基转移酶催化方法，尤其是tars,tarm两种酶共同作用的多种糖基转移酶依次催化方法，具体如下：

9、以5′-二磷酸尿嘧啶核苷-n-乙酰葡萄糖胺为糖基供体，通过多种糖基转移酶依次催化的方法，合成在一个wta分子上同时含有β和α构型的n-乙酰d葡糖氨基残基修饰的壁磷壁酸；具体的为采用tars,tarm两种酶先后依次催化的方法，其中tars,tarm两种酶的先后次序可以依据实际需要进行调整，本发明不做限制。

10、本发明的具体方法包括以下步骤：

11、步骤一，化学合成结构均一的多聚的1,5核糖醇磷酸酯；

12、步骤二，采用酶法对所述1,5核糖醇磷酸酯多聚物进行糖基化修饰，即得。

13、可选的，在本发明的一种实施方式中，所述n-乙酰基d-葡糖胺基残基为端基异构体构型α和端基异构体构型β。即所述n-乙酰基d-葡糖胺基残基是端基异构体构型α和β的混合形式。

14、本发明所述合成的多组分壁磷壁酸多糖可以与载体蛋白连接形成缀合物，该缀合物可作为糖蛋白疫苗，并且其中所述载体蛋白质向缀合物提供至少一个被t辅助淋巴细胞识别的表位。研究表明，本发明所涉及的多种构型壁磷壁酸糖缀合物具有较强的免疫活性，能诱导机体产生高滴度和多样的t细胞依赖的特异性igg抗体。值得注意的是，本发明得到的单个壁磷壁酸多糖分子可以同时修饰多种n-乙酰基d-葡糖胺基残基构型，并通过进一步制备成的寡糖疫苗免疫产生的抗体可以识别含有不同壁磷壁酸构型的金黄色葡萄球菌。

15、可选的，在本发明的一种实施方式中，所述的核糖醇-5-磷酸酯多聚物通过离子液体负载法高效且经济的得到。

16、可选的，在本发明的一种实施方式中，所述糖供体是5′-二磷酸尿嘧啶核苷-n-乙酰葡萄糖胺。

17、可选的，在本发明的一种实施方式中，所述壁磷壁酸多糖是通过化学酶法合成得到的，具体包括以下步骤：核糖醇-5-磷酸酯多聚物、糖供体与三种金黄色葡萄球菌壁磷壁酸n-乙酰d葡糖氨基糖基转移酶tars,tarm和tarp其中至少两种，合成具有两种以上n-乙酰基d-葡糖胺基残基构型的金黄色葡萄球菌壁磷壁酸。

18、可选的，在本发明的一种实施方式中，在壁磷壁酸n-乙酰d葡糖氨基糖基转移酶存在下，核糖醇-5-磷酸酯多聚物修饰n-乙酰d葡糖氨基残基的数量与加入糖供体的量成正相关，具体为：当核糖醇-5-磷酸酯多聚物与糖供体的当量比为1：5时，修饰2个n-乙酰d葡糖氨基残基；当核糖醇-5-磷酸酯多聚物与糖供体的当量比为1：10时，修饰4个n-乙酰d葡糖氨基残基。

19、可选的，在本发明的一种实施方式中，一条核糖醇-5-磷酸酯多聚物依次经过tars,tarm或tarm,tars两种壁磷壁酸n-乙酰d葡糖氨基糖基转移酶催化后，合成具有β和α两种不同构型的n-乙酰d葡糖氨基残基构型的金黄色葡萄球菌壁磷壁酸。所述依次经过tars,tarm或tarm,tars两种酶催化指的是tars,tarm两种酶以任意的先后次序进行均可，即可以是tars+tarm的顺序，也可以是tarm+tars的顺序。

20、可选的，在本发明的一种实施方式中，一条核糖醇-5-磷酸酯多聚物依次经过tars,tarm两种壁磷壁酸n-乙酰d葡糖氨基糖基转移酶催化的反应方程式如下：

21、

22、本发明的第二个方面，提供了一种多组分壁磷壁酸多糖的化学酶法合成方法，如以上任一所述的多组分壁磷壁酸多糖的化学酶法合成过程。

23、本发明的第三个方面，提供了一种多组分壁磷壁酸多糖，根据以上任一所述的多组分壁磷壁酸多糖的化学酶法合成得到。可选的，在本发明的一种实施方式中，所述多组分壁磷壁酸多糖具有两种以上n-乙酰基d-葡糖胺基残基构型，结构通式如下：

24、

25、其中，r1和r2满足：

26、其中任意一种，或

27、其中任意一种，或

28、其中任意一种。

29、可选的，在本发明的一种实施方式中，基于上述多种糖基化构型wta的抗原性，本领域基于常规研究思路可将其应用制备糖疫苗、或者基于其抗原性，将所述糖化合物作为分子识别标记用于携带药物、检测试剂等靶向不同wta表型的金萄菌。

30、可选的，在本发明的一种实施方式中，本发明的多组分壁磷壁酸多糖缀合物是一种新颖模式的多组分wta构型寡糖缀合物，所述寡糖缀合物由糖半抗原、连接臂及免疫载体依次连接构成。其中糖半抗原与传统的单一构型糖抗原不同，本发明的多组分糖抗原在一条1，5核糖醇磷酸酯多聚物上修饰了多种构型的n-乙酰d葡糖氨基，即采用以上所述的多组分壁磷壁酸多糖。

31、本发明第四方面，提供所述的与载体蛋白质共价结合的多组分壁磷壁酸多糖的缀合物在制备疫苗中的应用，即提供一种寡糖疫苗，包含所述的与载体蛋白质共价结合的多组分壁磷壁酸多糖的缀合物。动物免疫实验表明，本发明制备的糖缀合物疫苗免疫活性较强，均能在小鼠体内产生高滴度的igg抗体，结果还表明，本发明所述的多组分壁磷壁酸多糖偶联后的糖蛋白缀合物免疫后可以产生针对多种wta构型的igg，这一结果显示本发明制备的糖缀合物是一种非常有潜力的抗金葡菌感染的糖疫苗。

32、本发明第五方面，提供所述寡糖疫苗在制备预防金葡菌感染药物中的用途。基于本发明研究提供的所述糖疫苗可用于预防多种不同wta构型的金葡菌的感染，特别是针对一些mrsa。对医院和社区等高危人群预防金葡菌感染具有重要的意义。

33、以上一个或多个技术方案的有益效果是：本发明所述的与载体蛋白质共价结合的多组分壁磷壁酸多糖的缀合物，应用于制备疫苗，在动物实验中均表现出较好的免疫活性，拥有广谱的抗菌活性，具有广阔的应用前景。