用于心脏肥大治疗和诊断的LncRNA

本发明涉及药物组合物，包含：(i)促进一种或多种长非编码rna(lncrna)表达和/或活性的化合物，所述lncrna选自seq id no:12、8-11和13；和/或(ii)抑制一种或多种lncrna表达和/或活性的化合物，所述lncrna选自seq id no:1-7、27和28。本发明也涉及用于治疗或预防心脏肥大的化合物，所述化合物(i)促进一种或多种选自seq id no:12、8-11和13的lncrna表达和/或活性；和/或(ii)抑制一种或多种选自seq id no:1-7、27和28的lncrna表达和/或活性。本说明书中，引用了包括专利申请和厂商手册在内的多个文件。这些文件的公开内容通过引用全文纳入本文，尽管其不视作与本发明的专利性相关。更特别地，所有参考文献通过引用纳入，程度与各单独文献通过引用特定和单独指示纳入相同。

背景技术：

1、哺乳动物转录组的大规模分析发现基因组转录产生复杂比例的rna分子，其中仅一小部分用作蛋白合成模板。数个研究表明这些非编码rna (ncrna)如其编码蛋白质的对应物般具有重要生物学功能，指示改变ncrna表达或功能影响会影响心血管疾病，包括心脏肥大和纤维化、冠状动脉疾病以及心肌梗塞。

2、心血管研究中体现最多的ncrna是微rna(mirna，mir)。这些是由约20-22个核苷酸构成的内源、单链rna，所述核苷酸结合其它转录物，降低其靶标的稳定性和/或翻译。例如，显示mir-21和mir-132分别诱导纤维化或肥大，通过特异mirna拮抗剂(化学改造的沉默mirna的寡核苷酸)体内抑制这些mirna可在压力超负荷心脏疾病模型中避免(rescue)纤维化或肥大(thum等.nature.2008 456(7224):980-4.；ucar和gupta等.nat commun.2012 3:1078)。另一研究发现mir-24在缺血性心脏病中用作血管生成的关键调节因子(fiedler等.circulation.2011 124(6):720-30)。

3、近期研究表明与mirna类似，长ncrna (lncrna)也在多个生物过程中起重要作用。lncrna是范围从200个核苷酸到多至100千碱基的mrna样转录物，根据其相对于蛋白编码基因的基因组分布(对外显子和/或内含子有义、反义、双向或基因间)来分类。数个lncrna转录物专门限于核，而其它也在胞质中发现。在此，其与蛋白以及其它rna或dna分子相互作用，使lncrna能影响多种基因调控机制，包括染色质修饰、基因组印迹、核区室化和架构(architecture)以及转录和转录后调节(schonrock等.circ res.2012年10月26日；111(10):1349-62.；caley等.scientificworldjournal.2010 10:90-102)。不出所料，lncrna参与人类疾病，如癌、代谢和神经元异常。

4、然而，关于其在心血管生物学中的作用知之甚少。近期研究表明心脏和体壁中的心肌细胞分化及侧中胚层组织发育分别需要2个lncrna braveheart(bvht)和foxf1相邻非编码发育调控rna (fendrr)(klattenhoff等.cell.2013 152(3):570-83.；grote等.devcell.2013 24(2):206-14)。2种lncrna通过与染色质修饰复合体相互作用来调节细胞的表观遗传谱(profile)。近期报告也开始研究lncrna在心血管疾病中的作用。全基因组关联研究(gwas)鉴定基因座中的单核苷酸多态性(snp)，所述基因座编码lncrna mlat(心肌梗塞相关转录物)或anril(ink4基因座中的反义非编码rna)，其似乎与心肌梗塞或冠状动脉疾病风险相关(ishii等.j hum genet.2006 51(12):1087-99.；mcpherson等.science.2007316(5830):1488-91)。lncrna kcnq1ot1控制其反义基因kcnql的表达，所述基因编码钾通道。由于钾通道活性对正常心脏性能是必需的，lncrna相关的经改变调节可能导致心脏功能异常(korostowski等.plos genet.2012 8(9):e1002956)。

5、心脏疾病研究的主要挑战之一是鉴定调节基因网络或特异胞内信号通路的新型和有效方法，其可证明本身为有效治疗选择或具有提高现有治疗策略效率的潜能。意外发现特异lncrna在心脏肥大发展中起作用，从而提供新型治疗策略。

技术实现思路

1、因此，在第一方面，本发明涉及药物组合物，包含：(i)促进一种或多种长非编码rna(lncrna)表达和/或活性的化合物，所述lncrna选自seq id no:12、8-11和13；和/或(ii)抑制一种或多种lncrna表达和/或活性的化合物，所述lncrna选自seq id no:1-7、27和28。

2、根据本发明，术语“药物组合物”涉及给患者施用的组合物，优选人患者。本发明的药物组合物包括上述化合物。任选地，其还包括能改变本发明化合物特征的分子，从而例如稳定、调节和/或激活其功能。所述组合物可采用固体、液体或气体形式，尤其可采用一种或多种粉末、片剂、溶液或气雾剂形式。任选地，本发明的药物组合物另外包括药学上可接受载体或赋形剂。合适的药物载体和赋形剂示例为本领域熟知且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液、包括dmso在内的有机溶剂等。含有这类载体或赋形剂的组合物能通过熟知的常规方法配制。这些药物组合物能以合适剂量给对象施用。剂量方案由主治医生和临床因素确定。如医学领域熟知，用于任意患者的剂量取决于许多因素，包括患者尺寸、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、总体健康状况和同步施用的其它药物。用于给定情况的治疗有效量易通过常规实验测定并在普通临床医生或医生的技术和判断范围内。一般，作为药物组合物日常施用的方案应在每天1μg-5g单位范围内。然而，更优选的剂量范围可为每天0.01mg-100mg，甚至更优选0.01mg-50mg且最优选0.01mg-10mg。

3、此外，如果例如所述化合物是核酸序列如sirna，施用的总体药学上有效量的药物组合物通常小于约75mg/kg体重，例如小于约70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg/kg体重。更优选地，量小于2000nmol核酸序列(如约4.4x 1016个拷贝)/kg体重，例如小于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075或0.00015nmol sirna试剂/kg体重。

4、就反应发生观察治疗后变化和间隔所需的治疗长度根据所需效果而变化。具体量可由本领域技术人员熟知的常规测试确定。

5、本发明的药物组合物优选包括药学上可接受载体或赋形剂。“药学上可接受载体或赋形剂”指任何类型的无毒固体、半固体或液体填料、稀释剂、包封材料或制剂辅料(还参见《药物赋形剂手册》(handbook of pharmaceutical excipients)第6版,2010,医药出版社(pharmaceutical press))出版)。可采用剂量单位配制物施用所述药物组合物，所述施用通过例如口服，胃肠外如皮下、静脉内、肌肉内、腹腔内、鞘内、经皮、透粘膜、硬膜下、通过电离子透入局部或外用、舌下、吸入雾化、气雾剂或直肠等进行，任选地，所述配制物包括常规药学上可接受载体或赋形剂。

6、本文所用的术语“ncrna”或“非编码rna”指定未翻译成蛋白的功能rna分子。从中转录非编码rna的dna序列通常在本领域称为rna基因。术语“lncrna”或“长非编码rna”常用于本领域并指定含大于200个核苷酸的ncrna。seq id no:12、1-11、13、27和28包括132-1598个核苷酸范围的序列。

7、本发明的化合物可配制为囊泡，如脂质体。由于其特异性和从药物递送方面提供的作用持续时间，脂质体引起极大兴趣。脂质体递送系统用于体内有效递送核酸如sirna到细胞(zimmermann等.(2006)nature,441:111-114)。脂质体是单层或多层囊泡，具有形成自亲脂材料的膜和水性内部。所述水性部分包含待递送的组合物。阳离子脂质体具有能融合细胞壁的优势。非阳离子脂质体尽管不能有效融合细胞壁，但由巨噬细胞和其它细胞体内吞噬。抑制一种或多种选自seq id no:1-7、27和28的lncrna表达的化合物-如项目(ii)所定义-是本发明所述降低或防止一种或多种基因转录的化合物，所述基因编码选自seq idno:1-7、27和28的lncrna。这类化合物包括干扰转录机器和/或其与所述基因启动子和/或启动子远端表达控制元件如增强子相互作用的化合物。抑制选自seq id no:1-7、27和28的lncrna表达的化合物特异抑制所述lncrna表达，例如通过特异干扰控制lncrna表达的启动子区。优选地，选自seq id no:1-7、27和28的lncrna转录减少至少50％，更优选至少75％如至少90％或95％，甚至更优选至少98％且最优选约100％。抑制选自seq id no:1-7、27和28的lncrna活性的化合物-如项目(ii)所定义-根据本发明引起所述lncrna执行其功能但效率降低。抑制选自seq id no:1-7、27和28的lncrna活性的化合物特异抑制所述lncrna的活性。优选地，选自seq id no:1-7、27和28的lncrna活性减少至少50％，更优选至少75％如至少90％或95％，甚至更优选至少98％且最优选约100％。测定rna活性降低的途径和方法在本领域已确立且描述于例如esau等.(2004),jbc,279:52361-52365或gribbings等.(2009),nature cell biology 11,1 143-1149。如项目(ii)所定义的化合物可以是反义分子、sirna、shrna、抗体、核酶、适体或小分子。这些和其它化合物在下文进一步详述。

8、抑制化合物的效率能通过如下方法定量：比较有和没有抑制剂情况下的活性水平。例如，活性量度可作为：所形成lncrna量的变化。这种方法可以高通量形式实现以同时测试数种抑制化合物的效率。高通量试验独立于生化、细胞或其它试验，一般可在微量滴定板的孔中进行，其中各板可包含96、384或1536个孔。板的处理包括在环境温度以外的温度孵育、使测试化合物接触试验混合物，优选由一种或多种计算机控制的机器人系统实施，包括移液装置。在大的测试化合物库待筛选和/或筛选在短时间内完成的情况下，可向各孔加入例如10、20、30、40、50或100种测试化合物的混合物。在孔显示预期活性的情况下，所述测试化合物的混合物可去卷积以鉴定所述混合物中产生所述活性的更多测试化合物。

9、促进一种或多种选自seq id no:12、8-11和13的lncrna表达的化合物-如项目(i)所定义-可以是提高或上调选自seq id no:12、8-11和13的lncrna转录的任何化合物。这类化合物的非限制性示例是提高基因转录的转录因子，所述基因编码选自seq id no:12、8-11和13的lncrna，或是提高一种或多种选自seq id no:12、8-11和13的lncrna表达的小分子。转录因子是结合特异dna序列的蛋白，从而控制遗传信息从dna向rna转录。小分子是低分子量化合物，其定义上不是聚合物。促进一种或多种选自seq id no:12、8-11和13的lncrna活性的化合物-如项目(i)所定义-可以是引起所述lncrna在细胞中有效执行其功能的任何化合物。因此，采用最简单形式的这种化合物可以是选自seq id no:12、8-11和13的重组生成或分离的lncrna或其任何前体或片段。在此实施方式中，施用重组生成或分离的lncrna增加待治疗对象中的lncrna浓度。此较高浓度促进对象中各lncrna的总活性。所述片段必须保留或基本保留全长lncrna的功能。这种化合物也可以是能生成这类lncrna的载体或宿主。由此，所述片段必须是功能片段。还能使用选自seq id no:12、8-11和13的lncrna的直系同源或同源序列，来自不同种类，包括其前体或功能片段。在此方面，具有seqid no:12、8-11和13的人lncrna的优选同源序列分别是具有seq id no:25、21-24和26的各小鼠同源物。最优选的同源序列是seq no:12。或者，这种化合物可以是通过直接或间接与lncrna相互作用维持或甚至提高选自seq id no:12、8-11和13的lncrna活性的化合物。例如，这种化合物能防止选自seq id no:12、8-11和13的lncrna被核糖核酸酶降解或可以是相互作用伴侣如另一lncrna，其结合选自seq id no:12、8-11和13的lncrna并促进其活性。如项目(i)所定义的化合物在下文进一步详述。

10、如项目(i)所定义的化合物的效率还能通过如下方法定量：在lncrna的表达和/或活性促进化合物如转录因子存在或所述化合物缺失情况下，比较选自seq id no:12、8-11和13的lncrna表达和/或活性水平。例如，所形成lncrna量的变化可用作活性量度。所述方法优选以高通量形式实现，如上文进一步详述。

11、在第二方面，本发明涉及(i)促进一种或多种选自seq id no:12、8-11和13的lncrna表达和/或活性的化合物；和/或(ii)抑制一种或多种lncrna表达和/或活性的化合物以治疗或预防心脏肥大的化合物，所述lncrna选自seq id no:1-7、27和28。

12、结合本发明第一方面，如项目(i)和(ii)所定义的化合物在上文进一步详述。同一化合物能与本发明第二方面联用。

13、心脏肥大定义为心脏尺寸增加，而心肌细胞数没有增加。这引起心脏壁增厚。病理性心脏肥大响应不同压力形式所导致血液动力学超负荷而发生，如高血压、瓣膜疾病和心肌梗塞(ml)。延长的心脏细胞肥大性生长引起心律失常、心力衰竭且可导致猝死(frey n,olson en.cardiac hypertrophy:the good,the bad,and the ugly.annu revphysiol.2003；65:45-79)。因此，根据本发明，心脏肥大是不健康的心脏肥大(或病理性心脏肥大)，如响应压力或疾病例如高血压、心肌损伤(心肌梗塞)、心力衰竭或神经激素的心脏肥大。不健康的心脏肥大保持不同于健康的心脏肥大(生理性肥大或“运动员心脏”)，后者是正常的心脏反应，例如响应健身锻炼或怀孕。在健康对象中，赛艇运动员或自行车手往往心脏最大，平均左心室壁厚度是1.3厘米，相比之下普通成年人为1.1厘米。

14、为鉴定在心脏肥大发展中起作用的lncrna，采用主动脉缩窄(tac)小鼠模型(参见dealmeida等.(2010),j vis exp.2010年4月,(38))。tac小鼠模型在1991年建立。自此，该模型广泛用作有价值的工具以尽可能减少人心脏肥大并阐明参与心脏肥大反应的基础信号传递过程。

15、来自tac小鼠的分离rna用于完整心脏以及心肌细胞特异样品中的总lncrna谱，应用平台ncode和arraystar。意外发现tac小鼠中的特异lncrna相较负对照小鼠显著失调。这些lncrna选自谱数据(见表5)。通过pcr确认小鼠心脏组织中存在转录物且通过实时pcr验证失调。

16、从下文示例明显看出，本发明意外发现相较负对照小鼠，具有seq id no:1-7、27和28的人lncrna的小鼠同源物(即seq id no:14-20的lncrna)在tac小鼠模型中显著上调。在此方面，应注意人序列seq id no:1、27和28都是seq id no:14的小鼠序列同源物。由于人和小鼠不同的基因组重复事件，存在超过一个人同源物。发现所有3个人同源物在人心脏组织中表达且最突出发现在来自主动脉狭窄患者的肥厚心脏中上调(见图13b)。这些小鼠和人同源lncrna的上调与心脏肥大发展明显相关。因此，seq id no:14-20的小鼠lncrna以及seq id no:1-7、27和28的同源人lncrna是促肥大lncrna。可预期同源人lncrna具有与小鼠lncrna相同的功能。于是抑制seq id no:1-7、27和28的lncrna在人中的表达和/或活性会对治疗或预防心脏肥大有益。

17、从下文示例更显而易见的是，本发明揭示相较负对照小鼠，具有seq id no:12、8-11和13的人lncrna的小鼠同源物(即seq id no:25、21-24和26的lncrna)在tac小鼠模型中显著下调。这些小鼠lncrna的下调与心脏肥大发展明显相关。因此，seq id no:25、21-24和26的小鼠lncrna以及seq id no:12、8-11和13的同源人lncrna是抗肥大lncrna。于是促进seq id no:12、8-11和13的lncrna在人中的表达和/或活性会对治疗或预防心脏肥大有益。

18、结论是seq id no:14-20的小鼠lncrna是促肥大lncrna，而seq id no:25、21-24和26的小鼠lncrna是抗肥大lncrna，所述结论通过独立的体外模型进一步就促肥大rnalncrna gm11641(seq id no:14，人同源物seq id no:1、27和28)、抗肥大lncrna gm17499(seq id no:21，人同源物seq id no:8)和抗肥大lncrna h19(seq id no:25，人同源物seqid no:12)用实验证明。gm11641在本文中也称为chast(心脏肥大相关转录物)。肥大心肌细胞的标志是细胞尺寸相对于非肥大细胞增加。hl-1小鼠心肌细胞的体外肥大性生长和细胞尺寸增加能由苯肾上腺素(pe)和异丙肾上腺素(iso)诱导。因此，在第一实验设置中，pe和iso刺激后的hl-1小鼠心肌细胞尺寸在一定条件下研究，其中(a)lncrna gm11641表达受抑制以及(b)在一定条件下，其中lncrna gm11641表达提高(见图11)。与tac小鼠模型结果一致，发现lncrna gm11641过表达引起细胞尺寸相较负对照增加，而抑制lncrna gm11641可减少心肌细胞尺寸且进一步削弱pe/iso诱导的细胞尺寸增加。此外，gm11641过表达增加左心室肌肉质量并诱导心肌细胞生长(图38)。这些结果显示lncrna gm11641的促肥大功能。对应实验在第二和第三实验设置中进行，分别用lncrnas gm17499和h19。同样与tac小鼠模型结果一致，lncrna gm17499表达提高可防止促肥大刺激引起的hl-1细胞尺寸增加，而lncrna gm17499沉默会引起hl-1心肌细胞增大，指示此转录物的抗肥大功能(见图22)。这些结果显示lncrna gm17499的抗肥大功能。在抑制lncrna h19的实验中观察到类似结果(见图28-30)。重要的是，在人健康和肥厚心脏(归因于主动脉狭窄)组织中检测h19表达时，发现h19在肥厚心脏中强烈下调(见图31)。另外，h19敲减小鼠的体内结果表明h19对肥厚基因程序产生有益效果并用于抗肥大治疗(见图34和35)。

19、根据本发明第二方面的优选实施方式，所述心脏肥大是心室肥大。

20、大部分心脏肥大病例影响心室。尽管左心室肥大更常见，心脏肥大也能在右心室或2个心室中发生。心室是负责将血泵入肺(右心室)或身体其它部分(左心室)的心脏小室。

21、根据本发明第一和第二方面的优选实施方式，如(ii)所定义的化合物是(a)核酸序列，其包括与lncrna至少12个连续核苷酸互补的核苷酸序列或由其组成，所述lncrna选自seq id no:1-7、27和28，(b)核酸序列，其包括与一个或多个选自seq id no:1-7、27和28的lncrna互补链具有至少69％相同性的核苷酸序列或由其组成，(c)核酸序列，其包括根据(a)或(b)的核苷酸序列由其组成，其中u被t取代，(d)表达载体，表达如(a)-(c)中任一项所定义的核酸序列，优选地，在心脏特异启动子控制下表达，或(e)宿主，包括(d)的表达载体。

22、根据本发明，术语“核酸序列”或“核苷酸序列”包括dna如cdna，或在一个优选实施方式中，是基因组dna和rna。应理解本文所用的术语“rna”包括所有rna形式，包括在一个优选实施方式中的mrna或mirna。术语“核酸序列”根据本发明可与术语“多核苷酸”互换使用。

23、此优选实施方式的项目(a)-(c)所定义的核酸序列包含这样序列或由其组成，所述序列包含选自seq id no:1-7、27和28的lncrna的核苷酸或与其互补。因此，这些核酸序列包括或是反义核酸序列。用于使靶基因表达沉默的反义技术已确立并广泛用于本领域以治疗多种疾病。

24、本发明此优选实施方式的项目(a)所述分子包括这样的序列或由其组成，所述序列与seq id no:1-7、27和28中至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸、至少21个核苷酸、至少22个核苷酸、或所有23个核苷酸互补，依次更优选。这些至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸或至少21个核苷酸优选是seq id no:1-7、27和28的连续部分，即所述核苷酸在各seq id no中连续。

25、项目(a)所述分子优选是“sirna”。根据本发明，“sirna”指小干扰rna，也称为短干扰rna或沉默rna。sirna是一类18-30个，优选20-25个，最优选21-23个或21个核苷酸长度双链rna分子，在生物学中起多种作用。最显著的是，sirna参与rna干扰(rnai)通路，其中sirna干扰特异基因表达。除了其在rnai通路中的作用，sirna还作用于rnai相关通路，如作为抗病毒机制或基因组染色质结构成形。sirna具有明确结构：短双链rna(dsrna)，有利地，有至少一条rna链带突出。各链通常有5'磷酸基团和3'羟基(-oh)基团。此结构是dicer处理的结果，dicer是将长dsrna或短发夹rna转变成sirna的酶。sirna还能外源(人工)引入细胞以产生感兴趣基因特异性敲减。因此，序列已知的任何基因原则上能根据与合适定制sirna的序列互补性来靶向。双链rna分子或其代谢加工产物能介导靶标特异性核酸修饰，尤其是rna干扰和/或dna甲基化。还优选至少一条rna链具有5'-和/或3'-突出。双链末端之一或两者优选具有1-5个核苷酸的3'-突出，更优选1-3个核苷酸且最优选2个核苷酸。一般，本发明考虑适于用作sirna的任何rna分子。迄今最有效的沉默用sirna双链体获得，所述双链体由21-nt有义和21-nt反义链组成，配对成具有2-nt 3'-突出。2-nt 3'突出的序列对限于毗邻第一碱基对的未配对核苷酸的靶识别的特异性作用小(elbashir等.nature.2001年5月24日；411(6836):494-8)。3'突出中的2'-脱氧核苷酸与核糖核苷酸一样有效，但通常合成更便宜且可能更具核酸酶抗性。本发明所述sirna包含反义链，所述反义链包含与seq id no:1-7、27和28中至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸、至少21个核苷酸、至少22个核苷酸、或所有23个核苷酸(依次更优选)互补的序列或由其组成。这些至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸或至少21个核苷酸优选是seq id no:1-7、27和28的连续部分，即所述核苷酸在各seq id no中连续。

26、项目(a)所述分子优选是“shrna”。根据本发明，“shrna”是短发夹rna，其是形成(紧的)发夹弯的rna序列，所述发夹弯也能用于经rna干扰使基因表达沉默。shrna优选利用u6启动子来表达。shrna发夹结构由细胞机器切割成sirna，其随后结合rna诱导沉默复合体(risc)。此复合体结合并切割mrna，其匹配与之结合的shrna。本发明所述shrna包括：与seqid no:1-7、27和28中至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸、至少21个核苷酸、至少22个核苷酸、或所有23个核苷酸(依次更优选)互补的序列或由其组成。这些至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸或至少21个核苷酸优选是seq id no:1-7、27和28的连续部分，即所述核苷酸在各seq id no中连续。

27、上述本发明优选实施方式的项目(b)所述分子能与靶lncrna相互作用，更具体地，与靶lncrna杂交。通过形成杂交体，lncrna功能减少或被阻断。已描述涉及这类反义技术的标准方法(参见例如melani等.,cancer res.(1991)51:2897-2901)。因此，本发明所述术语“反义分子”涉及核酸分子，优选具有与给定lncrna，即“有义”序列，互补的碱基序列的rna分子。

28、项目(b)所述分子的特别优选示例是内切核糖核酸酶制备的sirna(esirna)。esirna是sirna寡核苷酸混合物，由内切核糖核酸酶如大肠杆菌(escherichia coli)核糖核酸酶iii或dicer切割项目(b)所述长双链rna(dsrna)产生。esirna是使用化学合成sirna进行rna干扰(rnai)的替代概念。esirna是长双链rna体外酶消化。为产生esirna，lncrna模板的cdna可由pcr扩增并带有2个噬菌体-启动子序列标签。然后，rna聚合酶用于产生与靶-基因cdna互补的长双链rna。此互补rna随后用来自大肠杆菌的核糖核酸酶iii消化产生sirna的短重叠片段，长度为18-25碱基对。此短双链rna的复合混合物类似dicer体内切割产生的混合物并因而称为内切核糖核酸酶制备的sirna或短esirna。因此，esirna是都靶向同一mrna序列的异源sirna混合物。esirna引起高度特异和有效的基因沉默。

29、项目(b)所述分子与选自seq id no:1-7、27和28的lncrna的序列相同性是至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％和100％，依次更优选。本领域已知测定序列相同性的途径和方法。优选地，用blast(基本局部比对搜索工具)程序测定关于一种或多种选自seq id no:1-7、27和28的lncrna的序列相同性。核酸序列的优选示例是一种或多种选自seq id no:14-20的lncrna的互补链，所述核酸序列包括与一种或多种选自seq id no:1-7、27和28的lncrna互补链具有至少69％相同性的核苷酸序列。

30、本发明的反义分子、sirna和shrna优选用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规rna合成仪来化学合成。rna合成试剂供应商包括proligo(德国汉堡)、dharmacon研究公司(dharmacon research，美国科罗拉多州拉法叶)、皮尔斯化学公司(pierce chemical，perbio科学公司(perbio science)的部分,美国伊利诺伊州罗克福德)、grc(glenresearch，美国弗吉尼亚州斯特林)、chemgenes(美国马萨诸塞州阿什兰)和cruachem(英国格拉斯哥)。

31、反义分子、sirna和shrna有力但可逆沉默lncrna和基因的能力在体内使这些分子尤其适合用于本发明的药物组合物。给人施用sirna的方法参见de fougerolles等.,current opinion in pharmacology,2008,8:280-285。这种方法也适合施用其它小rna分子如shrna。因此，这种药物组合物可直接配制为盐水施用，通过基于脂质体和基于聚合物的纳米颗粒方法施用，作为缀合或络合的药物组合物施用，或经病毒递送系统施用。直接施用包括注入组织、鼻内和气管内施用。基于脂质体和基于聚合物的纳米颗粒方法包括阳离子脂质genzyme lipid(gl)67、阳离子脂质体、壳聚糖纳米颗粒和阳离子细胞穿透肽(cpp)。缀合或络合的药物组合物包括pei-复合的反义分子、sirna、shrna或mirna。此外，病毒递送系统包括流感病毒包膜和病毒体。

32、反义分子、sirna和shrna可包括修饰核苷酸如锁核酸(lna)。lna核苷酸的核糖部分用连接2'氧和4'碳的额外桥修饰。所述桥“锁住”z'-内式(北)构象中的核糖，其通常见于a型双链体。需要时，lna核苷酸能与寡核苷酸中的dna或rna残基混合。这种寡聚物经化学合成且市售可得。锁定的核糖构象提高碱基堆积和主干预组织。这显著增强寡核苷酸的杂交特性(熔解温度)。尤其优选的sirna示例是gapmer(lnatm gapmer(exigon))。gapmer是有力的反义寡核苷酸，用于高度有效抑制mrna和lncrna功能。gapmer包含一段中央的dna单体，两侧是lna块。gapmer优选长14-16个核苷酸且可选全硫代磷酸化。dna缺口激活核糖核酸酶h介导的靶rna降解，也适于直接靶向核中的转录物。gapmer用于示例，如下调心肌细胞系hl-1的lncrna gm11641(seq id no:14)(图9)。

33、可与上面优选实施方式项目(d)联用的合适表达载体示例在下文详述。

34、根据本发明第一和第二方面的另一优选实施方式，如(ii)所定义的化合物是适体、核酶、抗体、蛋白药物或小分子抑制剂。

35、此实施方式的适体、核酶、抗体、蛋白药物或小分子抑制剂特异结合一种或多种选自seq id no:1-7、27和28的lncrna，从而抑制一种或多种选自seq id no:1-7、27和28的lncrna活性。

36、本发明所述术语“适体”指dna或rna分子，采用天然d构象或l构象(“镜像异构(spiegelmer)”)，根据其结合其它分子的能力选自随机库。所选适体结合核酸、蛋白、有机小化合物和甚至完整生物体。适体数据库维持于http://aptamer.icmb.utexas.edu/。更特别地，适体能分类为dna或rna适体或肽适体。前者由寡核苷酸链组成(通常较短)，后者由可变肽短结构域组成，两端都结合蛋白支架。核酸适体是核酸种类，其通过重复多轮的体外选择或等同的selex(指数富集配体进化)进行加工，以结合多种分子靶标如小分子、蛋白、核酸和甚至细胞、组织及生物体。本发明考虑的分子靶标是核酸，即选自seq id no:1-7、27和28的lncrna。因此，能针对本发明靶分子生成适体。肽适体是设计成干扰细胞内其它蛋白相互作用的肽。其由两端都结合蛋白支架的可变肽环组成。此双重结构限制使肽适体的结合亲和性大幅增加到与抗体相当的水平(纳摩尔范围)。可变环长度通常由10-20个氨基酸组成，所述支架可以是具有良好溶解性质的任何蛋白。目前，细菌蛋白硫氧还蛋白-a是最常用的支架蛋白，可变环插入还原活性位点，其是野生型蛋白中的-cys-gly-pro-cys-环，2条半胱氨酸侧链能形成二硫键。肽适体选择能用不同系统完成，但目前最常用的是酵母双杂交系统。

37、适体提供用于生物技术和治疗应用的效用，因为其提供比得上常用生物分子尤其是抗体的分子识别特性。除了其区分识别，适体提供相比抗体的优势，因为其能在试管中完整加工，易由化学合成生成，具有所需存储特性，并且在治疗应用引起很少免疫原性或不引起。非修饰适体从血流中迅速清除，半衰期为数分钟到数小时，主要归因于核酸酶降解和通过肾从体内清除，这是适体固有低分子量的结果。适体迅速清除可在应用如体内诊断成像中具有优势。数种修饰如2'-氟-取代嘧啶、聚乙二醇(peg)连接等对科学家而言可用，适体半衰期能增加到日或甚至周时间尺度。

38、术语“核酶”指没有蛋白时用作酶的rna分子。这些rna分子催化或自催化作用并能在特定靶位点切割例如其它rna，但也发现其催化核糖体的转氨酶活性。选择合适靶位点和对应核酶能如zaher和unrau(2007),rna 13(7):1017-1026所述完成。

39、良好表征的小自切割rna示例是锤头、发夹状丁型肝炎病毒和体外选择的前导依赖性核酶。这些小催化剂的组织与较大核酶如ⅰ型内含子相反。

40、催化自切割的原理在过去10年中已得到完善。在有核酶活性的rna分子中，锤头状核酶的特征鉴定最好。由于显示锤头状结构能整合入异源rna序列且核酶活性能因此转至这些分子，看来能对几乎任何靶序列产生催化序列，只要靶序列包含潜在匹配切割位点。

41、构建锤头状核酶的基本原理如下：选择一个含有guc(或cuc)三联体的有趣rna区。取2条寡核苷酸链并在其之间插入催化锤头状序列，所述链各有6-8个核苷酸。就多种靶序列合成此类分子。其显示体外催化活性，一些情况下还显示体内催化活性。最佳结果通常用短核酶和靶序列获得。靶序列是短rna序列，即选自seq id no:1-7、27和28的lncrna。选自seq id no:1-7、27和28的lncrna是用于生成核酶的真实靶序列，所述核酶能特异切割来自seq id no:1-7、27和28的lncrna。

42、适体和核酶还可包括修饰核苷酸，如锁核酸(lna)。

43、例如，本发明所用的术语“抗体”包括多克隆或单克隆抗体。此外，术语“抗体”也包括其仍保留结合亲和性的衍生物或片段。抗体片段或衍生物包括fab或fab'片段、fd、f(ab')2、fv或scfv片段、单结构域vh或v样结构域，如vhh或v-nar-结构域，以及多聚形式，如微抗体、双价抗体、三价抗体、四价抗体或化学缀合的fab'-多体(参见例如altshuler等.,2010.,holliger和hudson,2005)。术语“抗体”也包括实施方式如嵌合(人恒定结构域、非人可变结构域)、单链和人源化(人抗体，除了非人cdr)抗体。

44、用于生成抗体和其片段的多种技术为本领域熟知并描述于例如altshuler等,2010。因此，多克隆抗体能在用抗原与添加剂和佐剂的混合物免疫后获自动物血液，单克隆抗体能通过经连续细胞系培养提供抗体的任何技术生成。这类技术的示例描述于例如harlow和lane(1988)及(1999)，且包括最初由kohler和milstein,1975描述的杂交瘤技术、三源杂交瘤技术、人b细胞杂交瘤技术(参见例如kozbor,1983；li等.,2006)和ebv-杂交瘤技术以生成人单克隆抗体(cole等.,1985)。此外，重组抗体可获自单克隆抗体或能用多种展示法重头制备，如噬菌体、核糖体、mrna或细胞展示。用于表达重组(人源化)抗体或其片段的合适系统可选自例如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞系或转基因动物或植物(参见例如美国专利6,080,560；holliger和hudson,2005)。此外，描述以用于生成单链抗体所述的技术(参见美国专利4,946,778)能适于生成对本发明靶标特异的单链抗体。biacore系统所采用的表面等离子体共振能用于增加噬菌体抗体效率。

45、术语“蛋白药物”指定作为人蛋白衍生物的设计师药物。这些蛋白用作支架以通过完善的筛选程序(参见tomlinson等(2004),nature biotechnology,22(5):521-522)形成蛋白药物。用作支架以设计蛋白药物的人蛋白的非限制性示例是转铁蛋白、c型凝集素、三粘连蛋白(trinectins)、结构域抗体、kunitz结构域、脂质运载蛋白和fyn sh3结构域。

46、小分子抑制剂是低分子量有机化合物，其按照定义并非聚合物。本发明的小分子优选是以高亲和性结合seq id no:1-7、27和28的lncrna且另外抑制seq id no:1-7、27和28的lncrna活性的分子。小分子的分子量上限优选是1500da，更优选1000da且最优选800da，这允许迅速扩散穿过细胞膜的可能性，从而其能到达胞内作用位点。本领域已建立了有机小分子库和高通量技术，用于通过特异靶分子如本情况中选自seq id no:1-7、27和28的lncrna，来筛选这类库。

47、反义分子、sirna、shrna、抗体、酶、核酶、适体、蛋白药物或小分子抑制剂可融合脂质，如胆固醇。向核酸分子引入脂质修饰且尤其是胆固醇修饰的途径和方法参见krutzfeldt等.2005(nature 438,685-689)。例如，胆固醇可经羟基脯氨醇连接核酸分子。这种修饰提高核酸分子尤其是小rna摄入细胞的效率。

48、根据本发明第一和第二方面的另一优选实施方式，如(i)所定义的化合物是(a)核酸序列，其包括一个或多个选自seq id no:12、8-11和13的lncrna核酸序列或与其具有至少69％相同性的核酸序列，或由其组成，(b)表达如(a)所定义核酸序列的表达载体，优选在心脏特异启动子控制下表达，或(c)含有(b)的表达载体的宿主。

49、此优选实施方式项目(a)所述核酸序列可以是选自seq id no:12、8-11和13的重组生成或分离的lncrna，其任何前体或任何片段，只要维持在全长上与选自seq id no:12、8-11和13的lncrna具有至少69％的序列相同性。可使用选自seq id no:12、8-11和13的lncrna直系同源或同源序列，来自不同种类，包括其前体或功能片段。优选使用seq id no:21-26的各小鼠同源物。所述片段必须保留或基本保留全长lncrna的功能。因此，所述片段必须是功能片段。所含核酸序列与seq id no:8-13的lncrna具有至少69％相同性的特别优选序列示例分别是seq id no:21-26的小鼠同源lncrna。最优选的小鼠同源lncrna是seqid no:25。

50、项目(a)所述核酸序列与选自seq id no:12、8-11和13的lncrna序列相同性越来越偏好至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％和100％。本领域已知测定序列相同性的途径和方法。优选地，blast(基本局部比对搜索工具)程序用于测定关于一种或多种选自seq id no:12、8-11和13的lncrna的序列相同性。

51、根据上面优选实施方式的项目(b)和(c)，这种化合物也可以是能生成如项目(a)所定义核酸序列的表达载体或宿主。

52、表达载体可以是用于将特定转录物引入靶细胞的质粒。一旦表达载体在细胞内，基因所编码的蛋白通过细胞转录和翻译机器核糖体复合物生成。质粒一般改造成包含用作增强子和/或启动子区域和引起转录物有效转录的调节序列。根据本发明，所述表达载体优选包含心脏特异启动子。本领域已知心脏特异启动子，例如来自boecker等.(2004),molimagin.；3(2):69-75。这确保核酸序列仅表达于心脏且可避免其它器官表达带来的潜在的不需要的副作用。

53、表达载体的非限制性示例包括原核质粒载体如puc系列、pbluescript(stratagene)、表达载体pet系列(novagen)或pcrtopo(invitrogen)，以及与哺乳动物细胞表达相容的载体如prep(invitrogen)、pcdna3(invitrogen)、pcep4(invitrogen)、pmcineo(stratagene)、pxt1(stratagene)、psg5(stratagene)、ebo-psv2neo、pbpv-1、pdbpvmmtneo、prsvgpt、prsvneo、psv2-dhfr、plzd35、plxin、psir(clontech)、pires-egfp(clontech)、peak-10(edge biosystems)、ptriex-hygro(novagen)和pcineo(promega)。例如，适合毕赤酵母(pichia pastoris)的质粒载体示例包括质粒pa0815、ppic9k和ppic3.5k(都是invitrogen)。为配制药物组合物，根据良好生产规范选择合适载体。本领域已知这类载体，例如来自ausube等,hum gene ther.2011年4月；22(4):489-97或allay等.,hum genether.2011年5月；22(5):595-604。

54、典型哺乳动物表达载体包含启动子元件，其介导起始转录mrna、蛋白编码序列以及终止转录和转录物聚腺苷酸化所需信号。此外，也可纳入元件如复制起点、药物抗性基因、调节因子(作为诱导型启动子的一部分)。lac启动子是用于原核细胞的典型诱导型启动子，其能用乳糖类似物异丙基-b-d-硫代半乳糖苷(“iptg”)诱导。对于重组表达和分泌，感兴趣多核苷酸可在例如pelb前导信号与称为phen4的噬菌粒中基因iii之间连接，所述pelb前导信号指导周质中的重组蛋白(参见ghahroudi et al,1997,febs letters414:521-526)。额外元件可包括增强子、kozak序列和侧翼有rna剪接用供体和受体位点的间插序列。高度有效转录能用以下启动子完成：来自sv40的早期和晚期启动子，来自逆转录病毒的长末端重复(ltr)如rsv、htlvi、hivi，巨细胞病毒(cmv)的早期启动子。然而，还能使用细胞元件(如人肌动蛋白启动子)。例如，用于实践本发明的合适表达载体包括载体如psvl和pmsg(pharmacia,瑞典乌普萨拉)、prsvcat(atcc 37152)、psv2dhfr(atcc 37146)和pbc12mi(atcc 67109)。或者，重组(多)肽能表达于稳定细胞系，所述细胞系包含整合入染色体的基因构建体。用选择性标记如dhfr、gpt、新霉素、潮霉素共转染能鉴定和分离转染的细胞。还能扩增转染的核酸以表达大量编码的(多)肽。dhfr(二氢叶酸还原酶)用于开发携带数百个或甚至数千个感兴趣基因拷贝的细胞系。另一有用的选择性标记是谷氨酰胺合成酶(gs)(murphy等.1991,biochem j.227:277-279；bebbington等.1992,bio/technology 70:169-175)。使用这些标记，所述哺乳动物细胞生长于选择性培养基并选择抗性最高的细胞。如上所示，表达载体优选包括至少一种选择性标记。这些标记包括二氢叶酸还原酶、g418或用于真核细胞培养的新霉素抗性以及用于大肠杆菌(e.coli)和其它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。对于载体修饰技术，参见sambrook和russel(2001),《分子克隆：实验室手册》(molecular cloning:a laboratory manual),第3卷。一般，载体可包含一个或多个复制起点(ori)和用于克隆或表达的遗传系统，一个或多个用于宿主中选择的标记如抗生素抗性，以及一个或多个表达盒。例如，合适的复制起点(ori)包括col e1、sv40病毒和m13复制起点。

55、例如，插入载体的编码序列能由标准方法合成，或分离自天然来源。连接编码序列与转录调节元件和/或其它氨基酸编码序列能用已建立的方法完成。确保原核或真核细胞中表达的转录调节元件(部分表达盒)为本领域技术人员熟知。这些元件包括确保转录起始的调节序列(如翻译起始密码子、启动子、增强子和/或绝缘子)、内部核糖体进入位点(ires)(owens,proc.natl.acad.sci.usa 98(2001),1471-1476)，和任选地，确保转录终止和转录物稳定的poly-a信号。额外调节序列可包括转录以及翻译增强子，和/或天然相关或异源启动子区。优选地，如本发明上述优选实施方式的项目(a)所定义的核苷酸序列操作性连接这类允许原核或真核细胞中表达的表达控制序列。

56、所述宿主可以是原核或真核细胞。合适的真核宿主可以是哺乳动物细胞、两栖动物细胞、鱼细胞、昆虫细胞、真菌细胞或植物细胞。细菌细胞的代表性示例是大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)细胞；真菌细胞的代表性示例是酵母细胞；昆虫细胞的代表性示例是果蝇s2和夜蛾sf9细胞。优选所述细胞是哺乳动物，如人细胞。能使用的哺乳动物宿主细胞包括人hela、293、h9和jurkat细胞，小鼠nih3t3和c127细胞，cos 1、cos 7和cv1、鹌鹑qc1-3细胞，小鼠l细胞和中国仓鼠卵巢(cho)细胞。所述细胞可以是细胞系一部分，优选人细胞系。本领域已知用于上述宿主细胞的合适培养基和条件。所述宿主优选是宿主细胞，更优选分离的宿主细胞。所述宿主还优选是非人宿主。

57、根据本发明第一和第二方面的另一优选实施方式，如(i)所定义的化合物是(a)转录因子，促进一个或多个选自seq id no:12、8-11和13的lncrna表达，和/或(b)小分子，提高一个或多个选自seq id no:12、8-11和13的lncrna表达。

58、本文所用的术语“转录因子”定义结合特异dna序列的蛋白或肽，从而控制一个或多个选自seq id no:12、8-11和13的lncrna编码基因的转录。转录因子在活化选自seq idno:12、8-11和13的lncrna表达中的效率能用以下方法定量：比较有和没有转录因子情况下的lncrna水平。例如，所形成lncrna量的变化可用作活性量度。这种方法以高通量形式实现，从而同时测试数种抑制化合物的效率。高通量形式如上文进一步详述。

59、提高一个或多个选自seq id no:12、8-11和13的lncrna表达的小分子是低分子量有机化合物，其按照定义并非聚合物。本发明的小分子优选是以高亲和性结合seq id no:12、8-11和13的lncrna且另外抑制seq id no:11、8-11和13的lncrna活性的分子。小分子的分子量上限优选是1500da，更优选1000da且最优选800da，这允许迅速扩散穿过细胞膜的可能性，从而其能到达胞内作用位点。本领域已建立了有机小分子库和高通量技术，用于通过特异靶分子如本情况中选自seq id no:12、8-11和13的lncrna，来筛选这类库。

60、在第三方面，本发明涉及诊断患者心脏肥大的方法，包括(a)在获自所述患者的样品中检测一个或多个选自seq id no:12、1-11、13、27和28的lncrna表达水平，和(b)比较所述一个或多个lncrna表达水平与获自健康对象的样品中一个或多个lncrna表达水平，其中一个或多个选自seq id no:1-7、27和28的lncrna下调大于2倍；和/或一个或多个选自seqid no:12、8-11和13的lncrna上调大于2倍指示患者心脏肥大。

61、本发明第三方面所述方法还可包括检测和比较，与seq id no:12、1-11、13、27和28中任一种具有至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％和至少99.5％相同性(依次更优选)的一个或多个lncrna的表达水平。本领域已知测定序列相同性的途径和方法。优选地，blast(基本局部比对搜索工具)程序用于测定关于一种或多种选自seq id no:1-7、27和28和/或12、8-11和13的lncrna的序列相同性。本发明第三方面所述方法还可包括检测和比较与seq id no:1-7、27和28和/或12、8-11和13中任一种的差异不超过10个，如5、4、3、2或1个核苷酸(依次更优选)的一个或多个lncrna的表达水平。核苷酸差异可以是加入、缺失和/或取代核苷酸。尽管同源但仍比较其表达的序列也可彼此不同，越来越偏好不超过10个，如5、4、3、2或1个核苷酸。

62、术语“样品”指定组织样品或体液样品。体液样品优选选自血液、血清、血浆、尿、唾液、羊水、脑脊液和淋巴。组织样品优选是器官样品，如心脏、肝或肾样品。至于将所述方法应用于体液样品，应理解lncrna表达水平对应于lncrna浓度，因为lncrna不直接在体液中表达，但从细胞分泌，所述细胞将lncrna表达到体液中。

63、“患者”或“对象”在本文指人。

64、术语“检测lncrna表达水平”指测定lncrna的量或产量。lncrna初始在细胞内表达。根据本发明发现，seq id no:1-7、27和28和/或12、8-11和13的lncrna能在患者样品中检测到，尤其是心脏组织样品。因此，“样品中表达”的lncrna是表达水平能通过下文进一步详述的途径和方法在样品中检测到的lncrna。如果ncrna的量或产量显著高于对照样品中相应ncrna的量或产量，则ncrna在测试样品中上调。同样，如果ncrna的量或产量显著低于对照样品中相应ncrna的量或产量，则ncrna在测试样品中下调。此背景下，术语“相应ncrna”指例如测试样品中seq id no:1的lncrna表达水平与对照样品中seq id no:1的lncrna表达水平作比较，或同样，试样品中seq id no:2的lncrna表达水平与对照样品中seq id no:2的lncrna表达水平作比较。这参照适用于测定大于一种选自seq id no:12、1-11、13、27和28的lncrna表达的情况。例如，若在测试样品中测定seq id no:12、1-11、13、27和28的所有lncrna表达水平，其与对照样品中seq id no:12、1-11、13、27和28的所有lncrna表达水平作比较。

65、样品的表达水平能通过本领域可用的任何合适途径和方法定量。一般，能使用相对和绝对定量工具(mean)及方法。绝对定量不需要已知标准或对照。表达水平能直接量化。如本领域熟知，绝对定量可依赖于预定标准曲线。相对定量中，表达水平相对于参照(如已知对照表达水平)量化。同样在没有对照的情况下，当比较例如荧光强度时，能相对定量表达水平。

66、例如，评价rna浓度的方法可包括测量结合核酸并在结合时选择性发荧光的染料荧光强度。这种方法包括逆转录反应和生成cdna，其中测定cdna的量，从而间接确定rna的量。基于荧光的方法特别用于rna浓度过低以至于无法用分光光度法精确评估的情况和/或在260nm吸收的污染物使通过分光光度法精确定量困难或不可能的情况。

67、比较一种或多种lncrna在不同样品间的表达水平时，所述比较的可靠性优选通过纳入不变内源对照(参照基因的表达)来提高以校正潜在的样品间变化。这种涉及不变内源对照的标准化在本领域常规进行。例如，用于表达水平标准化的途径和方法如实时rt-pcr(参见例如bustin,journal of molecular endocrinology,(2002)29,23-39)或微阵列表达分析(参见例如calza和balwitan,methods mol biol.2010；673:37-52)已得到确立。用于小rna序列表达水平标准化的方法也已确立(参见例如mestdagh等.(2009)genomebiol.；0(6):r64)。在rt-pcr或微阵列用于根据本发明测定表达水平的情况下，表达水平优选针对加标rna标准化(参见例如mccormick等.(2011),silence,2:2)。已知量的加标rna在制备期间混合样品。更优选地，rna在完成rna分离过程前外部加标到血浆和/或血清，其中样品是血浆和/或血清。熟知加标rna技术且商业试剂盒可获自多个厂商。加标rna优选是加标秀丽隐杆线虫(c.elegans)rna。

68、从下文实施例可明显看出，一个或多个选自14-20和15-26的小鼠lncrna水平失调指示心脏肥大，如tac小鼠模型所证明。因此，可预期一个或多个选自12、1-11、13、27和28的各人同源lncrna表达水平具有诊断患者心脏肥大的预测价值。选自12、1-11、13、27和28的lncrna可联合其它心脏肥大诊断标志物以提高诊断方法置信度。高表达水平的选自1-7、27和28的lncrna和低表达水平的选自12、8-11和13的lncrna指示心脏肥大。

69、在下文实施例中，采用seq id no:29-62的引物序列以检测lncrna表达水平，其中奇数是正向引物而偶数是反向引物。连续数字如seq id no:29和30、seq id no:31和32、seq id no:33和34等是引物对。seq id no:29/30的引物对用于检测小鼠lncrna h19(seqid no:25)的表达水平，而seq id no:31/32的引物对用于检测人lncrna h19(seq id no:12)的表达水平。seq id no:39/40的引物对用于检测小鼠lncrna gm11641(seq id no:14)的表达水平，而3个人同源lncrna seq id no:1、27和28的表达水平能分别通过seq id no:33/34、seq id no:35/36和seq id no:37/38的引物对检测。

70、一个或多个这些引物对优选用于本发明第三方面所述诊断方法。一个或多个这些引物对同样优选纳入下文所述的本发明试剂盒。

71、依次更优选大于2倍下调、大于3倍下调、大于4倍下调、大于5倍下调、大于6倍下调、大于7倍下调和大于8倍下调。同样，依次更优选大于2倍上调、大于3倍上调、大于4倍上调、大于5倍上调、大于6倍上调、大于7倍上调和大于8倍上调。上调和下调的更高阈值可增加本发明第三方面所述方法的可靠性。

72、根据本发明第三方面的优选实施方式，所述样品是血液样品或血源性样品。

73、所述血源性样品优选是血浆或血清。

74、根据本发明第三方面的另一优选实施方式，所述样品是心脏组织样品。

75、所述心脏组织样品优选包括心脏壁的肌肉细胞，且最优选心室壁的肌肉细胞。

76、根据本发明第三方面的另一优选实施方式，检测一个或多个lncrna表达水平包括(a)定量pcr，优选定量实时pcr，或(b)模板/rna扩增法，然后用基于荧光或发光的定量法测定一个或多个lncrna表达水平。

77、定量pcr(qpcr)中，扩增产物的量与荧光强度相关联，采用荧光报告分子。测量荧光信号以计算初始模板量的点可以是反应结束(终点半定量pcr)或扩增仍在推进时(实时qpcr)。

78、终点半定量pcr中，在扩增反应完成后收集荧光数据，通常30-40个循环后，此终荧光用于反演计算pcr前存在的模板量。

79、更敏感和可重复的实时qpcr法随着扩增推进来测量各循环的荧光。这在限制试剂、抑制剂积聚或聚合酶失活开始对扩增效率产生影响前，允许模板定量基于扩增指数期中的荧光信号。这些早期反应循环的荧光读数会测量扩增的模板量，其中样品间的反应比终点的可重复性高许多。

80、模板/rna扩增法然后用基于荧光或发光的定量法测定一个或多个lncrna表达水平的非限制性示例是组合转录介导扩增技术(tma)与杂交保护实验(hpa)的方法。更详细地，这种方法可包括杂交一种或多种与任何seq id no:12、1-11、13、27和28互补的寡核苷酸(“捕获寡核苷酸”)。在两种或更多seq id no:12、1-11、13、27和28被靶向的情况下，单独捕获寡核苷酸用于选自12、1-11、13、27和28的各序列。杂交的靶序列随后在磁性微粒上捕获，其在磁场中与样品分开。洗涤步骤可用于移出外来组分。靶扩增通常经tma发生，tma是基于转录的核酸扩增法，采用2种酶即莫洛尼鼠白血病病毒(mmlv)逆转录酶和t7 rna聚合酶。一组独特的引物用于选自12、1-11、13、27和28的各靶序列。逆转录酶用于产生靶序列的dna拷贝(含用于t7 rna聚合酶的启动子序列)。t7 rna聚合酶从dna拷贝生成多拷贝的rna扩增子。检测lncrna表达水平通过hpa实现，用与一个或多个扩增子互补的单链、化学发光标记的核酸探针。优选地，可区分标记的探针用于各靶扩增子。标记的核酸探针与扩增子特异性杂交。然后，“选择试剂”通过灭活未杂交探针上的标记来区分杂交和未杂交探针。检测步骤中，杂交探针生成的化学发光信号用光度计测量并报告为“相对光单位”(rlu)，从而定量lncrna表达水平。

81、根据本发明第三方面的另一优选实施方式，所述方法包括在检测长非编码rna表达水平前，测试患者样品和/或对照患者样品内rna的预扩增步骤。

82、进行预扩增步骤在仅少量(测试和/或对照)样品可用的情况下特别具有优势。预扩增步骤允许增加样品内的rna量，然后进入表达水平分析。预扩增rna的途径和方法为本领域熟知(参见例如vermeulen等(2009)bmc res notes.,2:235)。在测试和对照样品中的rna都预扩增的情况下，优选采用同一方法用于预扩增步骤，从而维持测试样品相较对照样品的相对rna量。在仅测试或对照样品的rna预扩增或两种rna样品由不同方法预扩增的情况下，表达水平数据可能必须就预扩增步骤标准化；参见例如mestdagh等.(2009),genomebiology 2009,10:r64。

83、在第四方面，本发明涉及诊断患者心脏肥大的试剂盒，所述试剂盒包括检测一个或多个选自seq id no:12、1-11、13、27和28的lncrna表达水平的方法，以及如何使用试剂盒的说明书。

84、关于如何使用试剂盒的说明书优选告知高表达水平的选自1-7、27和28的lncrna和低表达水平的选自12、8-11和13的lncrna指示心脏肥大。

85、检测一个或多个选自seq id no:12、1-11、13、27和28的lncrna表达水平的工具优选(i)定量pcr，优选定量实时pcr，所需的工具，或(ii)模板/rna扩增法，然后用基于荧光或发光的定量法测定一个或多个lncrna表达水平所需的工具。这些工具结合本发明第三方面如上文进一步详述，且可包括在试剂盒中。因此，所述工具优选包括寡核苷酸，如荧光杂交探针或引物，其与一个或多个选自seq id no:12、1-11、13、27和28的lncrna特异性杂交。所述试剂盒的其它成分可以是荧光或发光染料，优选偶联所述寡核苷酸。所述试剂盒的其它成分也可以是酶，如逆转录酶和/或聚合酶。

86、根据本发明的试剂盒，检测一个或多个选自seq id no:12、1-11、13、27和28的lncrna表达水平的工具优选包括检测seq id no:12的lncrna的工具。

87、所述试剂盒的多种组分可包装于一个或多个容器，如一个或多个小瓶。除了所述组分，小瓶还可包括防腐剂或缓冲剂用于存储。

88、根据本发明第四方面的一个优选实施方式，所述工具是引物对，用于特异检测一个或多个选自seq id no:12、1-11、13、27和28的lncrna表达水平。

89、根据本发明所有四方面的一个优选实施方式，一个或多个lncrna是至少3个lncrna，优选至少5个lncrna。

90、采用seq id no:12、1-11、13、27和28的至少3个lncrna，优选至少5个lncrna，更优选至少10个lncrna，甚至更优选至少20个lncrna和最优选所有lncrna，会额外增加本发明药物组合物、医学应用、方法和试剂盒的效力。采用这些数量的lncrna可平衡与本发明方法和试剂盒联用的特定化合物、探针或方法相关的潜在差异。

91、在本发明的药物组合物和医学应用中，这些数量的lncrna可增加对待治疗对象的有益效果。

92、根据本发明所有四方面的一个优选实施方式，一个或多个lncrna是或包括seq idno:12的lncrna。

93、seq id no:12是人lncrna h19。同源小鼠lncrna h19由seq id no:25表示。lncrna h19的抗肥大性质由下文的实施例3证明。在人和其它动物中发现h19 lncrna基因。h19基因的调节被良好描述为基因组印迹典范且还参与人类遗传病和癌症。出生后，h19主要表达于肌肉组织，在该处其促进分化和再生。lncrna在心脏中的生物学功能仍不明了。就发明者的最佳知识而言，h19在心脏肥大中的作用或功能未知，但意外发现与本发明有关。h19在多个哺乳动物种中进化上保守，包括小鼠和人(见图32和33)。

94、根据本发明所有四方面的另一优选实施方式，一个或多个lncrna是或包括seq idno:1,27或28的lncrna，其中最优选seq id no:1。

95、如上文所讨论，seq id no:1、27或28是小鼠lncrna gm11641(seq id no:14)的人同源lncrna，应注意人与小鼠不同的基因组重复事件产生各小鼠lncrna的一种以上同源人lncrna(见图13a和b)。lncrna gm11641的促肥大性质在下文实施例中由2个独立心脏肥大测试系统证明，所述系统是tac小鼠模型和苯肾上腺素(pe)及异丙肾上腺素(iso)处理的hl-1小鼠心肌细胞。

96、根据本发明所有四方面的另一优选实施方式，一个或多个lncrna是或包括seq idno:8的lncrna。

97、如上文所讨论，seq id no:8是小鼠lncrna gm17499(seq id no:21)的人同源lncrna。lncrna gm7499的抗肥大性质在下文实施例中由独立测试系统证明。