一种具有生物活性的医用敷料胶原蛋白海绵制备方法与流程

本发明涉及新型生物医用材料术领域，具体涉及一种具有生物活性的医用敷料胶原蛋白海绵制备方法。

背景技术：

1、目前，在外科手术中需要大量的胶原敷料。胶原敷料主要有明胶海绵或交联后的胶原蛋白海绵，其中，大多使用的是明胶海绵止血，但是，这种材料亲水性差，止血效果不佳。明胶海绵由于胶原蛋白三维螺旋结构被破坏，不再具有生物活性，分子量降低，导致力学性能差，且极易于降解；胶原蛋白海绵，在临床上具有良好的止血作用，能使创口渗血区血液很快凝结，被人体组织逐渐吸收，一般用于内脏手术时的毛细血管渗出性出血。当前，胶原蛋白海绵临床应用已包括普通外科、心血管外科、整形外科、泌尿外科、骨科、皮肤科、烧伤科、妇产科以及口腔科、耳鼻喉科、眼科等几乎所有的手术，应用十分广泛。

2、但是，在胶原蛋白海绵制备过程中，同组织中分离纯化得到的胶原蛋白在纯度、理化性质和胶原蛋白构型方面有显著的差异，其吸水速率慢，吸水倍率低，力学强度低，生物活性差。目前，胶原蛋白海绵制备常用的方法是经酶消化后提纯，冷冻干燥制得，也有少数学者(范春娣等)采用基因工程发酵法获得类人胶原蛋白，但其成纤维性不及天然胶原，所以其广泛应用有待验证。

3、因此，如何克服明胶海绵由于胶原蛋白三维螺旋结构被破坏，不再具有生物活性，分子量降低，导致力学性能差，且极易于降解，不利于后期创面的止血及愈合修复的问题，以及改善胶原蛋白海绵制备过程海绵孔隙率和吸水率低、i型胶原蛋白纯度低的问题，制备出更好的，适用于外科手术的胶原敷料，是当前急需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有的胶原蛋白海绵制备过程中存在的问题。本发明的具有生物活性的医用敷料胶原蛋白海绵制备方法，选择与人类胶原蛋白结构相似的牛跟腱为原料，将牛跟腱处理并脱脂除杂后，采用酸-酶(酸溶、酶解)结合法从沉淀中提取ⅰ型胶原(交联反应胶原)，解决普通胶原蛋白海绵孔隙率和吸水率低、i型胶原蛋白纯度低等问题，具有良好的应用前景。

2、为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

3、一种具有生物活性的医用敷料胶原蛋白海绵制备方法，包括以下步骤，

4、步骤(a)，选择与人类胶原蛋白结构相似的牛跟腱为原料；

5、步骤(b)，对牛跟腱原料进行预处理；

6、步骤(c)，对预处理后的牛跟腱进行碱处理；

7、步骤(d)，对碱处理后的牛跟腱进行酸溶，得到牛跟腱酸溶溶液；

8、步骤(e)，对牛跟腱酸溶溶液进行酶解，得到上清液的胶原液；

9、步骤(f)，对上清液的胶原液进行盐析，得到盐析胶原；

10、步骤(g)，对盐析胶原进行溶胀透析，得到溶胀透析胶原；

11、步骤(h)，对溶胀透析胶原进行交联，得到交联反应胶原；

12、步骤(i)，对交联反应胶原进行模具冷冻成型，制成医用敷料胶原蛋白海绵；

13、步骤(j)，对医用敷料胶原蛋白海绵进行灭菌、包装，完成医用敷料胶原蛋白海绵的制备。

14、前述的具有生物活性的医用敷料胶原蛋白海绵制备方法，步骤(b)，对牛跟腱原料进行预处理，具体过程如下：

15、(b1)，浸泡并清洗牛跟腱原料，剪掉牛跟腱外侧多余脂肪；

16、(b2)，将(b1)处理后的牛跟腱冷冻2～4h后，切片切条，并通过组织绞肉机进行捣碎处理，完成牛跟腱原料的预处理。

17、前述的具有生物活性的医用敷料胶原蛋白海绵制备方法，步骤(c)，对预处理后的牛跟腱进行碱处理，具体过程如下：

18、(c1)，配制5％～8％浓度的碳酸钠溶液或碳酸氢钠溶液；

19、(c2)，将配制好的碳酸钠溶液或碳酸氢钠溶液倒入预处理后的牛跟腱中，用玻璃棒搅拌后浸泡18～24h，其中，牛跟腱与碳酸钠溶液或碳酸氢钠溶的料液比为1g:30ml～1g:50ml；

20、(c3)，将(c2)处理后的牛跟腱倒入滤网中并清洗干净，完成牛跟腱的碱处理。

21、前述的具有生物活性的医用敷料胶原蛋白海绵制备方法，步骤(d)，对碱处理后的牛跟腱进行酸溶，得到牛跟腱酸溶溶液，具体过程如下：

22、(d1)，配制浓度为2％～5％的乙酸溶液；

23、(d2)，将配制好的乙酸溶液倒入碱处理后的牛跟腱中，用玻璃棒搅拌后浸泡36～48h，牛跟腱酸溶溶液，其中牛跟腱与乙酸溶液的料液比为1g:40ml～1g:50ml。

24、前述的具有生物活性的医用敷料胶原蛋白海绵制备方法，步骤(e)，对牛跟腱酸溶溶液进行酶解，得到上清液的胶原液，具体过程如下：

25、(e1)，按照100g牛跟腱需要1g～5g胃蛋白酶的比例计算所需的胃蛋白酶酶；

26、(e2)，将计算所需的胃蛋白酶酶加入牛跟腱酸溶溶液中，用搅拌机每2h搅拌时间30～50min，进行酶解6h～8h，酶解反应后，得到酶解溶液；

27、(e3)，酶解反应的终止需要浓度为30％的过氧化氢溶液，按照酶解溶液体积的1％～2％比例加入，使用搅拌机搅拌2～3h，得到胶原粗液；

28、(e4)，对胶原粗液进行进行抽滤，滤出得到胶原粗提液；

29、(e5)，对胶原粗提液进行离心处理，按照离心速度10000rpm，离心时间30～40min，得到上清液的胶原液。

30、前述的具有生物活性的医用敷料胶原蛋白海绵制备方法，步骤(f)，对上清液的胶原液进行盐析，得到盐析胶原，具体过程如下：

31、(f1)，通过碱液调节上清液的胶原液的ph值至4.5～6.5，所述碱液可选氨水或氢氧化钠溶液；

32、(f2)，按照质量体积比m/v为100(g/l)～150(g/l)的比例，将氯化钠加入碱液调节后的上清液的胶原液，使用搅拌机搅拌10～15min，搅拌转速控制在6000～8000rpm之间；再减速继续搅拌2h～4h，搅拌转速控制在4000～5000rpm之间，进行盐析；

33、(f3)，将盐析后的上清液的胶原液，放入滤网清洗，得到盐析胶原。

34、前述的具有生物活性的医用敷料胶原蛋白海绵制备方法，步骤(g)，对盐析胶原进行溶胀透析，得到溶胀透析胶原，具体过程如下：

35、(g1)，配制浓度为0.5％～2％的溶胀溶液，所述溶胀溶液的溶胀试剂选择柠檬酸、草酸、乙酸或冰醋酸中的一种或多种；

36、(g2)，将盐析胶原分成若干份，缓慢加入溶胀溶液，并采用搅拌机低速搅拌30～50min，搅拌转速控制在800-1200rpm之间，至胶原完全溶解，形成均透明胶原液；

37、(g3)，将透明胶原液置于2～8℃冰箱中，静置浸泡24～48h；

38、(g4)，将(g3)处理后的透明胶原液进行透析处理，用纯化水透析4～7天，得到溶胀透析胶原。

39、前述的具有生物活性的医用敷料胶原蛋白海绵制备方法，步骤(h)，对溶胀透析胶原进行交联，得到交联反应胶原，具体过程如下：

40、(h1)，配制浓度为3％～30％的交联溶液，所述交联溶液采用戊二醛交联体系，交联温度为20～37℃，交联时间为4～24h；

41、(h2)，采用电子天平称量戊二醛交联剂的质量，按照交联剂含量0.004％～0.1％的比例计算所需的戊二醛交联剂质量，将量取的戊二醛交联剂缓慢加入溶胀透析胶原中，采用搅拌机搅拌1h进行交联反应，搅拌转速控制在3000-5000rpm之间；

42、(h3)交联反应后采用冷冻离心机进行离心脱泡，脱泡后得到交联反应胶原，离心脱泡的转速控制在6000rpm，离心脱泡的时间为60min。

43、前述的具有生物活性的医用敷料胶原蛋白海绵制备方法，步骤(i)，对交联反应胶原进行模具冷冻成型，制成医用敷料胶原蛋白海绵，所述模具冷冻成型为冷冻干燥方式，采用冻干机冻干方式实现，冻干温度为-40℃～25℃，干燥时间为30～72h，具体为：预冻温度为-45±5℃；预冻时间为4-12h；冷冻干燥时间为24-72h；

44、步骤(j)，对医用敷料胶原蛋白海绵进行灭菌，灭菌方式采用co60辐射灭菌。

45、前述的具有生物活性的医用敷料胶原蛋白海绵制备方法，步骤(b)、步骤(c)、步骤(f)，所述的清洗过程，均需要顺时针不停搅拌，冲洗后挤出多余水分，再加入新的水浸泡，重复冲洗浸泡至少3次，所述水均为纯化水。

46、本发明的有益效果是：本发明的具有生物活性的医用敷料胶原蛋白海绵制备方法，选择与人类胶原蛋白结构相似的牛跟腱为原料，将牛跟腱处理并脱脂除杂后，采用酸-酶(酸溶、酶解)结合法从沉淀中提取ⅰ型胶原(交联反应胶原)，解决普通胶原蛋白海绵孔隙率和吸水率低、i型胶原蛋白纯度低等问题；本发明通过将动物跟腱(牛跟腱)采用特殊的多次溶解、盐析、溶胀透析、交联纯化过程，最终制得纯度大于90％的高纯度i型胶原蛋白，具有以下优益效果：

47、(1)本发明制备采用化学交联法，即用化学交联剂如醛类使胶原分子内或分子间形成共价键。其交联可形成致密的网络结构，并提高胶原材料的机械性能等。因此制备的胶原蛋白海绵力学性能良好，吸水溶胀后不易散裂，孔隙率高，且能达到高于自身重量20倍的高吸水力，可用于伤口及自然腔道填充。

48、(2)本发明制备的胶原蛋白海绵，可生物降解、具有良好的细胞适应性，促进细胞增殖和促进血凝等特点，可用于创面快速止血，可有效快速止血，防止创面血液渗出。

49、(3)本发明利用酸-酶结合及多种特殊工艺结合来提取胶原，可以去除非螺旋区具有抗原性的末端肽。使胶原的提取率提高，且反应速度快，环境污染较小，杂质含量少、纯度高，水溶性良好。

50、(4)本发明的胶原蛋白海绵系以牛跟腱为原材料经提取制得，主要成分为ⅰ型胶原蛋白，具有低免疫原性、具有良好生物活性及相容性，通过制造过程中的特殊工序，降低免疫原性，使胶原蛋白海绵的安全性得到更好的保障。