一种透明质酸功能化的铂纳米酶及其气管瘘口治疗应用

本发明公开了一种透明质酸功能化的铂纳米酶及其气管瘘口治疗应用，属于纳米医学、再生医学和组织工程领域。

背景技术：

1、气管瘘是由机械通气时间过长、钝性创伤、支架相关损伤、癌症、异物或接触腐蚀性化学物品等原因引起的气管管壁破坏，可导致患者生活质量下降、生存期缩短甚至死亡。气管瘘的部分较小瘘口存在一定自行闭合的机率，但是较大的瘘口难以自行愈合，因此气管瘘仍是临床医生在工作中常见的棘手的问题之一。目前气管瘘的主要治疗方法包括手术、介入治疗和保守治疗。上述疗法虽在气道瘘治疗上有一定的效果，但疗效仍不理想。由于瘘口病理微环境的特殊性，常规手段往往疗效欠佳。目前大量研究表明，炎症、缺氧、肿瘤、糖尿病等因素都会导致伤口局部过度的氧化应激。因此，主动调控瘘口微环境，降低瘘口部位氧化应激水平，对于气管瘘的愈合和修复有重要的研究意义。

2、纳米酶是一类具有类酶活性的纳米材料，因其具有高稳定性，可批量生产且经济适用等特点，受到了各领域研究者关注。其中，铂纳米酶具有比表面积大、表面能高以及催化、抗氧化和吸附能力强等特性，已在生物传感、免疫分析、癌症治疗及纳米医学等研究领域显示出广阔的应用前景。本专利基于透明质酸钠作为配体搭载了铂纳米酶，发明了一种兼具有多种类酶活性、抗氧化应激和止血等多功能性的透明质酸功能化铂纳米酶，并将其进一步应用于气管瘘的治疗。该纳米酶在气管瘘动物模型上获得显著的抗炎、促血管生成及促伤口修复等疗效，可作为气管瘘组织修复和再生的理想材料。

技术实现思路

1、本发明的目的是结合了透明质酸钠(sha)的固有生物活性和铂(pt)纳米颗粒(np)的类酶活性，获得了一种可用于气管瘘治疗的复合纳米酶(本发明简称sha-ptnps)。结果表明，sha-ptnps具有良好的分散性、较小的颗粒尺寸(3.7nm)和高稳定性，同时，sha-ptnps具有过氧化氢酶样、超氧化物歧化酶样活性和羟基自由基清除能力，可以发挥自由基清除能力。在细胞层面，sha-ptnps可发挥多功能特性，包括生物相容性、促进细胞增殖和迁移的能力、血液相容性和止血作用等。在体内实验的兔气管瘘模型中，sha-ptnps显示出显著的促进瘘口闭合疗效，主要特征是局部炎症的减少，血管的生成，气道上皮的形成，胶原纤维的合成且有序排列等，并在治疗期间未观察到显著的副作用。

2、本发明的目的是这样实现的，一种透明质酸功能化的铂纳米酶，其特征是：由下述方法制备而成：取0.2g的透明质酸钠sha加入50ml去离子水中完全溶解，加入2ml的h2ptcl6溶液，搅拌混匀30分钟后逐滴滴入1ml的nabh4溶液，保持避光，磁力搅拌反应90分钟，所制得的sha-ptnps的平均粒径为3.7nm，晶格间距为0.226nm，以及由82％的pt0和18％的pt4+组成。

3、上述所得到的sha-ptnps具有过氧化物酶活性和类超氧化物歧化酶活性，酶活力分别为2709u/g和108u/mg，并观察到sha-ptnps在一周内仍维持较高的水平的类酶活性，在室温放置一个月后，sha-ptnps的类酶活性仍能保持90％以上。

4、上述所得到的sha-ptnps具有清除羟基自由基的能力，并能显著降低氧化应激诱导下的细胞ros水平，具有清除自由基和抗氧化应激的能力。

5、上述所得到的sha-ptnps在体外细胞实验中，具有良好的生物相容性、促增殖和迁移的能力、血液相容性和止血能力。

6、本发明所述的一种透明质酸功能化的铂纳米酶在制备治疗气管瘘口的药物中的应用。

7、所述的应用，其特征是：在体内实验的兔气管瘘模型中，sha-ptnps显示出显著的促进瘘口闭合疗效，显示特征是局部炎症的减少，血管的生成，气道上皮的形成，胶原纤维的合成且有序排列，并在治疗期间未观察到显著的副作用。

8、具体地说，本发明主要采用以下技术方案：

9、(一)sha-ptnps的制备

10、1.1准确称取0.2g的透明质酸钠(sha)，于搅拌的情况下加入50ml去离子水中，充分搅拌直至sha完全溶解(约15min)。取47ml sha溶液，加入2ml h2ptcl6溶液(10mmol/l)，室温下避光磁力搅拌混匀30分钟后，在剧烈搅拌的同时逐滴滴入1ml nabh4溶液(60mmol/l)(nabh4溶液临用新制，于5min之内加完)，保持避光，磁力搅拌反应90分钟，即制得sha-ptnps。制备流程示意图如技术路线图1所示。反应结束后将其避光保存于4℃环境中。

11、(二)sha-ptnps的酶学性质与自由基清除能力

12、2.1类过氧化氢酶活性

13、2.1.1类过氧化氢酶活性验证

14、分别加入磷酸盐缓冲液(pbs)(2000μl，20mmol/l，ph＝7.4)，过氧化氢(1000μl，100mmol/l)，sha(100μl，3.8mmol/l)，sha-ptnps(100μl，3.8mmol/l)，与空白组pbs(2ml，20mmol/l，ph＝7.4)在室温下观察是否有气泡产生。

15、2.1.2类过氧化氢酶活力单位的测定与计算

16、按顺序加入pbs(2000μl，20mmol/l，ph＝7.4)，去离子水(900μl),过氧化氢(1ml，100mmol/l)，sha-ptnps(100μl，3.8mmol/l)测其在240nm处的吸光度随时间变化规律，每1分钟测一次，一共测4分钟。根据下列公式计算类过氧化氢酶活力单位(u/g)得到sha-ptnps的类过氧化氢酶活力单位。

17、

18、2.2类超氧化物歧化酶活性

19、2.2.1类超氧化物歧化酶(sod)活性验证：

20、采用了黄嘌呤氧化酶氧化黄嘌呤的氯化硝基四氮唑蓝(nbt)法作为定量和定性的方法对类sod酶活性进行分析。通过黄嘌呤氧化产生的o2·-将与nbt反应生成水溶性染料甲瓒，在正常情况下，nbt被o2·-还原，然而，在sha-ptnps的存在下则被分解，抑制了nbt的还原。sha-ptnps对nbt还原的抑制作用表现出sod样活性。

21、利用电子自旋共振光谱(esr)检测sha-ptnps和sha的o2·-的清除能力。将黄嘌呤氧化酶(1μl)、黄嘌呤(20μl)与磷酸盐缓冲液缓冲液(20mmol/l，159μl，ph＝7.4)混合后室温下孵育30min。随后将超氧阴离子捕获剂dmpo(100mmol/l，30μl)与30μl上述混合物反应，5min后检测esr信号。

22、2.2.2类超氧化物歧化酶活力单位的测定与计算

23、同时，使用黄嘌呤氧化法对类超氧化物歧化酶活力单位进行测定。根据sod活性检测试剂盒(nbt法)说明书加样测定，在37℃孵育30分钟。并于560nm处测定吸光值。通过说明书上的公式(如下式)进行计算得到类超氧化物歧化酶活力单位。

24、

25、

26、2.3羟基自由基清除能力

27、2.3.1羟基自由基清除能力验证：

28、利用电子自旋共振光谱(esr)检测sha-ptnps和sha对·oh-的清除能力。将h2o2(100mmol/l，980μl)和hrp(2mg/ml，20μl)在磷酸盐缓冲液(20mм，2.9ml，ph＝7.4)中混合，并在室温下孵育8分钟。随后，将sha-ptnps或sha(3.8mg/ml，100μl)加入混合物中，并在常温下反应12分钟。将羟基自由基捕获剂dmpo(100mmol/l，30μl)与30μl上述混合物一起加入反应，esr法测定sha-ptnps或sha与·oh-的反应。

29、2.3.2羟基自由基清除能力测定：

30、用对苯二甲酸(ta)作为荧光指示剂检测羟基自由基(·oh-)。按顺序加入pbs(2700μl，20mmol/l，ph＝7.4)，ta(200μl，2mmol/l)，过氧化氢(980μl，100mmol/l)，hrp(2mg/ml，20μl)，sha(100μl，3.8mmol/l)和sha-ptnps(100μl，3.8mmol/l)与空白组检测荧光强度。

31、(三)sha-ptnps的抗氧化应激能力

32、3.1细胞内的活性氧(ros)可将无荧光的dcfh-da氧化生成有荧光的dcf进而可以反应细胞内ros水平。

33、(1)种板、分组：为了研究铂纳米酶在细胞水平的ros清除活性，将人永生化表皮细胞(hacat)和人支气管上皮细胞(hbe)以1×105/孔密度接种12孔板上，分为阴性对照组(con组)、阳性对照组(con+h2o2组)、sha组(sha+h2o2组)、sha-ptnps组(sha-ptnps+h2o2组)4组，每组3个复孔，培养24小时细胞贴壁后，除去培养基，分别予0.9％生理盐水、sha(3.8mg/ml)、sha-ptnps(3.8mmol/l)的培养基混合液进行共孵育12小时后，洗涤3次并继续与浓度为100μm的h2o2 pbs溶液共培养2小时。

34、(2)装载探针：按照1:1000用无血清培养液稀释dcfh-da，使终浓度为10μmmol/l。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的dcfh-da。加入稀释好的dcfh-da0.5ml。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的dcfh-da。荧光显微镜观察：分别设置激发波长为488nm，发射波长为525nm，实时检测刺激前后荧光的强弱。

35、(3)定量分析胞内ros水平：将hacat和hbe细胞以1×104/孔密度接种96孔板上，干预方法如上述(1)，使用多功能酶标仪检测细胞内dcf荧光强度。

36、(四)sha-ptnps的生物相容性

37、4.1cck-8细胞增殖和毒性检测试验

38、(1)收集处于对数生长期的hacat和hbe细胞，消化细胞并制成悬液，稀释至5000个细胞/孔，于96孔板中每孔中加入100μl的细胞悬液，另设调零孔，每组6个复孔，记录接种时间。置于37℃，5％co2培养箱中培养。

39、(2)设定24h、48h、72h三个检测时间点，在每个检测时间点加入10μl cck-8液体，于37℃，5％co2培养箱中继续孵育1h。

40、(3)用酶标仪测定波长在450nm处的吸光值并记录各孔od。

41、(4)每24h、48h、72h记录光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。

42、4.2平板划痕实验

43、(1)细胞种板：当细胞生长融合至80％-90％，消化重悬后进行细胞计数。以每孔2×105个的密度接种至6孔板中。

44、(2)划线制造空白区域：种板24小时后用枪头垂直划取5条直线/孔。用pbs洗细胞3次，洗去划下的细胞。

45、(3)将sha、sha-ptnps与无血清培养基进行稀释混匀加入6孔板，空白对照组加入等量的0.9％生理盐水，置于37℃、5％co2培养箱培养。选择0、12、24h时间点进行观察拍照并量化不同时间点的迁移面积。

46、4.3血液相容性

47、(1)收集8周，雄性sd大鼠血液2ml加入到10ml pbs中，混匀后放置1h。

48、(2)在4℃，5000r/min的条件下将其混悬液离心5分钟，并用pbs洗3次直至上清液无色或者微黄色。

49、(3)弃去上层液体，取下层的红细胞500μl加到24.5ml pbs中重悬得到2％的rbc混悬液备用。

50、(4)取2％的rbc混悬液500μl分别与500μl去离子水(阳性对照)，pbs(阴性对照)，不同浓度的材料在37℃烘箱中孵育1h。

51、(5)孵育结束后，10000r离心5分钟后取上清液100μl到96孔板中测定540nm处的吸光值。

52、(6)溶血率的计算公式：溶血率(％)＝(am-ap)-(ab-ap)/(ad-ap)×100％，其中am，ap，ad为红细胞和材料，pbs，去离子水共孵育的吸光值，ab为材料本身的吸光值。

53、4.4 sha-ptnps的类酶活性短期稳定性

54、使用紫外-可见分光光度法对sha-ptnps的类酶活性进行了短期稳定性的实验。观察sha-ptnps的类酶活性在30天内仍维持较高的水平，从而推断其具有良好的时间稳定性。

55、(五)sha-ptnps的止血效果

56、5.1取15只8周雄性sd大鼠(250～300g)，每剂量组n＝15在实验室(室温22±2℃，湿度60％)至少适应7天。用2％戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉后将大鼠放置于恒温加热垫上(以保持它们的体温)，尾巴伸直。酒精棉球消毒后用手术刀将大鼠的尾巴从尾部4厘米处快速截下，分别在断端处涂抹0.9％生理盐水、sha(3.8mg/ml)、sha-ptnps(3.8mmol/l)各500μl，然后立即置于室温下观察出血时间(观察期在30秒内未观察到血迹时停止)和测量出血重量。

57、(六)透明质酸钠-铂纳米酶的生物学效果及在伤口愈合修复的应用

58、6.1新西兰兔气管瘘口实验

59、6.1.1新西兰兔建模

60、(1)实验动物选择：健康新西兰兔，雄性，体重3.0-3.5kg，于标准动物中心饲养。随机分为3组：con组、sha组、sha-ptnps组。

61、(2)麻醉药品准备：3％戊巴比妥钠、2％利多卡因；

62、(3)术前准备：麻醉后固定四肢于手术台；颈前区剃毛脱毛，消毒，铺巾；

63、(4)手术方法：确认气管所在位置，在切口沿线的中点两侧，分别用血管钳向两侧夹起皮肤，用手术剪作长约4cm的颈前区正中切口，钝性分离皮下组织及气管旁肌肉，左右两侧分别以止血钳牵拉气管旁肌肉以暴露气管；

64、(5)瘘口建立：暴露气管，于环状软骨下2cm，第3-5软骨环建立大小约5mm×5mm的瘘口，瘘口边缘光滑，直径均匀；

65、(6)药物治疗：于瘘口四周黏膜下选取4点90°环形黏膜下注射，并使用明胶海绵作为承载体，而后逐层缝合。

66、6.1.2气管瘘口愈合面积

67、①标本采集：于4周，使用戊巴比妥钠处死实验兔，剃去颈前部毛发，剪开皮肤及肌层组织，取出气管组织，取材主要为瘘口及周边1cm，用生理盐水洗净，放入4％福尔马林固定12h，蜡块包埋，按照5μm厚度切片行苏木精&伊红染色(he)染色、masson染色、免疫组化。

68、②解剖大体组织对比：手术当天及相应解剖观察点，测量记录兔子治疗前后的体重、瘘口大小及愈合面积；伤口愈合时间为创面重新被新组织覆盖的时间。伤口范围由示踪伤口边缘的方式确定。伤口愈合程度的计算方法如下：[(d0伤口面积-d28伤口面积)/d0伤口面积]×100％。

69、③重要脏器组织毒性观察：分别于2周和4周，使用戊巴比妥钠安乐死处死实验兔，观察sha-ptnps对心、肝、脾、肺、肾等重要脏器组织的安全性。

70、本发明的优点：

71、1.多功能铂纳米酶具有优异的类过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等多种类酶催化活性，体外实验表明其具有良好的生物相容性、促细胞增殖和迁移、抗氧化应激和止血效果。

72、2.体内实验进一步验证了多功能铂纳米酶可有效促进动物模型中呼吸道瘘口的愈合和修复，表现出显著的促瘘口增殖、抗炎和促进血管再生的疗效。