一种基于细胞外囊泡的肿瘤纳米疫苗及其制备方法与应用

本发明涉及肿瘤生物学领域，特别涉及一种基于细胞外囊泡的肿瘤纳米疫苗及其制备方法与应用。

背景技术：

1、手术切除及化疗目前仍然是三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌和胰腺导管癌等实体瘤的主要治疗手段，但由于复发转移、化疗耐药等原因限制了实体瘤的治疗，研究者们一直在积极寻求更有效的治疗手段。近年来，免疫治疗在多种肿瘤中取得了突破性进展，但大部分实体瘤患者从中获益极其有限。因此，创新免疫治疗方案是肿瘤临床治疗亟待解决的问题。抗原加工提呈是抗肿瘤免疫反应启动的关键步骤。树突状细胞(dc)作为功能最强的抗原提呈细胞，已被广泛研究用于增强抗肿瘤免疫反应。但细胞衰老死亡、淋巴浸润能力差及易受机体免疫系统抑制等缺点限制了dc疫苗的临床应用。

2、由于纳米材料被细胞摄取以后，会激发细胞的自我保护机制，并被细胞以胞吐的形式排出。研究人员利用这一特性构建了可以实现肿瘤深部递送体系。利用细胞“内吞-外排”的过程可以实现纳米材料的仿生化修饰，进而构建了细胞自加工的细胞膜仿生化修饰纳米药物，并用于肿瘤等疾病的治疗。这种将纳米材料的药物储库作用和细胞内吞-外排生命活动结合所构建的仿生化纳米药物递送系统，具有更高的生物相容性。

技术实现思路

1、本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于细胞外囊泡的肿瘤纳米疫苗的制备方法。

2、本发明的另一目的在于提供所述方法制备得到的基于细胞外囊泡的肿瘤纳米疫苗。

3、本发明的再一目的在于提供所述基于细胞外囊泡的肿瘤纳米疫苗的应用。

4、本发明的目的通过下述技术方案实现：

5、一种基于细胞外囊泡的肿瘤纳米疫苗的制备方法，包括如下步骤：

6、(1)合成维生素e阳离子表面活性剂vecl

7、将维生素e(ve)溶解到无水二氯甲烷中，在冰水浴条件下加入无水三乙胺，在保护性气体氛围下加入丙烯酰氯，搅拌反应，待反应结束后用饱和氯化钠水溶液洗涤、无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去二氯甲烷，得到丙烯酰化维生素e；然后将丙烯酰化维生素e和n，n-二乙基-1，3-丙二胺混合后，在保护性气体氛围、90±5℃下搅拌反应，再加入丙酮和碘甲烷进行回流反应，待反应结束后冷却、过滤收集沉淀，干燥，得到维生素e阳离子表面活性剂vecl；

8、(2)制备ve阳离子脂质体纳米粒cnp

9、将步骤(1)中得到的维生素e阳离子表面活性剂vecl与聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)溶解到水/丙酮混合物中，然后用移液枪将其注入到搅拌的水中形成脂质体纳米球，然后离心收集脂质体纳米球，得到ve阳离子脂质体纳米粒cnp；

10、(3)将肿瘤抗原吸附到cnp表面形成cnp-org

11、将肿瘤患者自体来源的肿瘤组织培养成肿瘤类器官，待肿瘤类器官生长到直径为200～400μm，经反复冻融裂解，得到肿瘤抗原；然后将肿瘤抗原与步骤(2)中得到的ve阳离子脂质体纳米粒cnp在4℃搅拌条件下共孵育，再离心收集得到cnp-org；

12、(4)制备包载cnp-org的细胞外囊泡cnp-org@mv

13、将步骤(3)中得到的cnp-org和健康人外周血dc细胞共孵育1～8h(让dc摄取足够多cnp-org)，然后经紫外光照射后更换为新鲜的培养基继续培养16～30h(以产生足够量的微泡)，再离心收集，得到包载cnp-org的细胞外囊泡cnp-org@mv，即所述的基于细胞外囊泡的肿瘤纳米疫苗。

14、步骤(1)中所述的维生素e(ve)、三乙胺和丙烯酰氯的质量比为0.83：(0.2～1.6)：(0.16～0.8)；优选为0.83：0.8：0.36。

15、步骤(1)中所述的二氯甲烷的用量为按每克维生素e配比50～70ml二氯甲烷计算；优选为按每克维生素e配比60ml二氯甲烷计算。

16、步骤(1)中所述的保护性气体优选为氮气。

17、步骤(1)中所述的搅拌反应的时间为12～48h；优选为24h。

18、步骤(1)中所述的用饱和氯化钠水溶液洗涤的次数优选为三次以上。

19、步骤(1)中所述的丙烯酰化ve、n，n-二乙基-1，3-丙二胺和碘甲烷的质量比为1：(0.01～0.2)：(0.1～10)；优选为1：0.1：1。

20、步骤(1)中所述的丙酮的用量为按每克丙烯酰化ve配比10～200ml丙酮计算；优选为按每克丙烯酰化ve配比100ml丙酮计算。

21、步骤(1)中所述的90±5℃下搅拌反应的时间为12～72h；优选为48h。

22、步骤(1)中所述的回流反应的时间为6～48h；优选为12h。

23、步骤(1)中所述的冷却的时间为0.5～6h；优选为2h。

24、步骤(1)、(2)和(3)中，搅拌为采用磁力搅拌器进行搅拌，搅拌转速优选为500rpm。

25、所述的磁力搅拌器的型号为mms4 pro 1147。

26、步骤(2)中所述的维生素e阳离子表面活性剂vecl与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1：(5～50)；优选为1：20。

27、步骤(2)中所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重均分子量为40000～75000。

28、步骤(2)中所述的水/丙酮混合物中水和丙酮的体积比为(0.1～10):1；优选为1:1。

29、步骤(2)中所述的水/丙酮混合物的用量为按每毫克维生素e阳离子表面活性剂vecl配比0.1～5ml水/丙酮混合物计算；优选为按每毫克维生素e阳离子表面活性剂vecl配比0.5ml水/丙酮混合物计算。

30、步骤(2)中所述的脂质体纳米球的粒径大小约为100±10nm。

31、步骤(2)、(3)和(4)中所述的离心的条件为：先4℃、3000rpm离心1～30min(优选为5min)去除大颗粒(能有效除去细胞碎片，又能充分保留微泡成分)，然后再4℃、12000rpm离心30～120min(优选为60min)收集产物(脂质体纳米球、cnp-org或包载cnp-org的细胞外囊泡cnp-org@mv(能收集到尽量多的微泡，同时不影响离心后微泡的分散))。

32、步骤(2)中所述的ve阳离子脂质体纳米粒cnp优选为保存在pbs缓冲液或生理盐水中。

33、步骤(2)中所述的水/丙酮混合物与形成脂质体纳米球所用的水的体积比为1：(10～100)；优选为1：50。

34、步骤(3)中所述的肿瘤优选为胰腺癌。

35、步骤(3)中所述的肿瘤类器官可根据中国专利(申请号为202210490409.0，名称为“一种利用肿瘤患者自体来源的类器官衍生微泡包载化疗药物的方法及其应用”)中的方法培养获得。

36、步骤(3)中所述的反复冻融通过如下步骤实现：将肿瘤类器官置于液氮中快速冷冻后，再在37±2℃条件下快速解冻，重复2～4次(优选为3次)。

37、步骤(3)中所述的ve阳离子脂质体纳米粒cnp和肿瘤抗原的质量比1：(1～100)；优选为1：50。

38、步骤(3)中所述的共孵育时间为1～4h；优选为2h。

39、步骤(3)中所述的cnp-org优选为保存在pbs缓冲液或生理盐水中。

40、步骤(4)中所述的健康人外周血dc细胞为通过健康人外周血分离、诱导得到；优选为通过如下方法制备得到：用人淋巴细胞分离液(ficoll)从健康人外周血中先分离出单个核细胞(pbmc)；然后加入含100ng/ml gm-csf和20ng/ml il-4的培养基进行培养4～5天(优选为5天)，更换新的培养基继续培养2～4天(优选为3天)，再加入终浓度为200ng/ml的脂多糖(lps)和20ng/ml的il-6共刺激，获得健康人外周血dc细胞。

41、所述的单个核细胞(pbmc)的分离步骤如下：在离心管中倒入人淋巴细胞分离液(ficoll)，然后加入健康人外周血，离心，吸取中间白膜层，加入pbs缓冲液离心洗涤后，再加入dmem培养基，转移至细胞培养板培养至细胞贴壁，收集贴壁细胞，得到单个核细胞。

42、所述的人淋巴细胞分离液和健康人外周血的体积比优选为3：5。

43、所述的pbs缓冲液和健康人外周血的体积比4：5。

44、所述的离心的条件优选为：4℃、450g离心25min。

45、所述的离心洗涤的条件优选为：4℃、450g离心10min。

46、所述的离心洗涤的次数为2～3次。

47、所述的共刺激的时间为12～48小时；优选为24小时。

48、步骤(4)中所述的cnp-org的用量为按每克cnp-org配比1x108～1x1012个健康人外周血dc细胞计算；优选为按每克cnp-org配比1x1010个健康人外周血dc细胞计算。

49、步骤(4)中所述的cnp-org和健康人外周血dc细胞共孵育的时间优选为4h。

50、步骤(4)中所述的紫外照射条件：利用功率为8w、波长为254nm的紫外灯照射30～90min，以刺激产生足够的细胞外囊泡又不至于杀死细胞；优选为：利用功率为8w、波长为254nm的紫外灯照射60min。

51、步骤(4)中所述的紫外照射后共孵育的时间优选为24h。

52、步骤(4)中所述的包载cnp-org的细胞外囊泡cnp-org@mv优选为保存在pbs缓冲液或生理盐水中。

53、一种基于细胞外囊泡的肿瘤纳米疫苗，通过上述任一项所述的方法制备得到。

54、所述的基于细胞外囊泡的肿瘤纳米疫苗在制备用于肿瘤免疫治疗的疫苗制剂中的应用。

55、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

56、1.本发明首先制备了一种新型阳离子表面活性剂vecl，并利用其制备了阳离子脂质纳米材料cnp，然后利用该纳米材料特性吸附肿瘤患者来源类器官裂解物中的肿瘤抗原，刺激dc“内吞-外排”的过程，制备包载该吸附肿瘤抗原纳米材料的细胞外囊泡(cnp-org@mv)。

57、2.本发明中制备的肿瘤疫苗cnp-org@mv是一种肿瘤免疫治疗新策略，具有增强t细胞杀伤活性的能力，能促进癌组织中成熟dc与t细胞的浸润，并且能够显著抑制肿瘤生长，该疫苗能够重塑肿瘤微环境，有效提高免疫治疗效果；与传统dc疫苗相比，该疫苗利用阳离子纳米材料搭载类器官肿瘤抗原，外部包被dc细胞囊泡，使该体系具有更高的肿瘤靶向性，生物相容性，能够调控肿瘤微环境逆转肿瘤免疫耐受。

58、3.本发明中制备的基于细胞外囊泡的肿瘤疫苗cnp-org@mv相比于dc疫苗具有以下优势：(1)用基于细胞外囊泡的纳米疫苗代替dc细胞，cnp-org@mv克服了传统dc疫苗因细胞耗竭死亡导致的疗效下降问题；(2)用细胞产物代替完整活细胞，cnp-org@mv避免了传统dc疫苗过度激活导致的全身性过敏反应；(3)在肿瘤微环境中，cnp-org@mv尺寸远小于dc细胞，更容易达到肿瘤，可避免因肿瘤诱发免疫失能导致的疗效降低。

59、4.本发明利用来自患者自体来源的人体肿瘤类器官抗原及健康人外周血来源的dc细胞构建疫苗，该疫苗回输患者能够实现个体化给药和精准医疗，有良好的转化潜力。