多巴胺透明质酸粘性水凝胶及其制备方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及两种由多巴胺修饰的透明质酸水凝胶体系。这两种水凝胶体系被证明具有较强的粘性，同时具有较好的生物相容性，可用于创伤修复、组织再生、结构支撑多种领域。

背景技术：

1、向ha凝胶赋予粘性的特征，通常采取的办法是利用具有较强粘性的聚多巴胺(pda)结构。起初，人们发现贻贝足丝蛋白mefp-5序列中含有大量的左旋多巴，且这些左旋多巴构成的聚合结构是该蛋白具有表面粘附性的原因。pda具有与贻贝粘性蛋白类似的结构，因而也具有在湿润表面粘附的特性；且由于pda能够吸收大量自由基、抗氧化、络合某些金属离子、具有良好的生物相容性，所以被广泛用作生物材料，产生粘附、抗菌、组织修复等功能。

2、将多巴胺或者类似结构的小分子连接到ha凝胶体系中有不同的方法。这些方法一方面与所选材料有关，另一方面，研究者们也希望能够产生足够的接枝率，因为形成pda的量以及凝胶所表现出的粘性显然与多巴胺分子的接枝率有关。将多巴胺直接接枝到ha上大致有两种方法，一种是利用酰胺化反应直接接枝，另一种是将ha氧化为oha后，通过schiff碱缩合接枝。也有通过其它连接分子将多巴胺或者类似结构的分子接枝到ha上的手段，例如xue等人使用己二酰肼将异硫氰酸多巴胺(dopamine-isothiocyanate)接枝到ha上，在产生多巴胺结构的同时，还产生了一个硫脲的结构，后者也是可以参与交联的活性基团。如果使用hama作为凝胶的原材料，那么也可以将多巴胺同样改造成甲基丙烯酰多巴胺(dma)，与hama共同交联；但该反应可能还需要水以外的溶剂。另外，也可以在体系中引入专门接枝多巴胺的大分子，用以提高体系中多巴胺的含量。以上凝胶体系均可以在交联的过程中产生显著的粘性。至于多巴胺的类似物，单宁酸(ta)、原儿茶醛(pa)等含有邻苯二酚结构的天然小分子也有制备粘性水凝胶的报道，如qiao等人制备的cs/ta/sf水凝胶，因其具有优异的湿环境组织粘合能力，被用作快速止血的材料；liang等人使用季铵盐与pa修饰的壳聚糖制成ph敏感的水凝胶，同时带有组织粘附特性。

3、在湿组织表面粘合材料是比较困难的。因此，目前为止，除一些药物递送、生物电子学方面的研究外，具有粘性的水凝胶主要被应用于创伤止血、组织修复等领域。值得注意的是，其中绝大多数的应用场景是软组织；作为一类水凝胶材料，尽管具有不错的粘接能力，但力学性质仍然是制约其应用的一个重要因素。

4、尽管先前的研究报道了一些使水凝胶带有粘性的解决方案，但如何开发出一种具有可靠粘性，且生物相容性较好、能应用于组织损伤修复的水凝胶材料，仍是一个亟待解决的问题。

5、在先前的研究中，也存在4-arm peg与ha共同制备生物材料的尝试。例如，文献就报道了一种以4-arm peg与ha通过静电作用形成的凝胶；在这个体系中，4-arm peg端基修饰了带有正电荷的聚甲基丙烯酸氨基乙基酯，带有负电荷的透明质酸钠则未经修饰；然而对于4-arm peg的修饰步骤繁琐，且用到了有毒的cu(i)盐。还有报道使用oha与氨基端基的4-arm peg形成交联，但oha被怀疑有一定的生物毒性。更简单的体系则是由hama与4-armpegma通过低温冷冻并冻干形成的冷冻凝胶，但是其并非是水凝胶体系。而使用4-armpegma、hama和多巴胺成分制备带有粘性的水凝胶材料则是无人报道的。

技术实现思路

1、在水凝胶应用于创伤修复的领域，使材料对组织表现出粘附性，对于其可靠性与功能性至关重要，也是研究者们常常关注的一种材料特性。然而，在湿环境中使材料表现出较强的粘性，同时又具有一定的力学强度以及较好的生物相容性，至今仍然是具有挑战性的问题。本发明在实验室团队先前开发的丝素蛋白—透明质酸水凝胶体系的基础上，使用多巴胺修饰透明质酸分子并掺入凝胶体系，使之带有了较强的粘性；后续的细胞及动物实验表明，材料同时具备较好的生物相容性。

2、本发明的目的是提供一种多巴胺透明质酸粘性水凝胶体系，所述水凝胶体系表现出较强的粘性和生物相容性。

3、本发明所提供的多巴胺透明质酸粘性水凝胶体系，由4-arm pegma和hama、odoha为原料制成，记为4-arm pegma/hama/odoha水凝胶体；

4、其中，4-arm pegma表示四臂聚乙二醇-甲基丙烯酸酯，hama表示甲基丙烯酸酯化透明质酸，odoha表示多巴胺通过schiff碱缩合接枝的氧化透明质酸，其结构式如下所示：

5、

6、其中，所述4-arm pegma和hama、odoha的质量比可为2.5～5：0.5～1.5：0.5～1.5，具体可为5：1：1.5。

7、上述多巴胺透明质酸粘性水凝胶体系通过包括如下步骤的方法制备得到：将4-arm pegmapbs溶液与含hama、odoha和光交联剂的pbs溶液混合，在高碘酸钠作用下，蓝光光照交联，得到4-arm pegma/hama/odoha水凝胶体系。

8、其中，所述水凝胶体系中，4-arm pegma的质量浓度为2.5％～5％，优选为5％；hama的质量浓度为0.5％～1.5％，优选为1.0％；odoha的质量浓度为0.5％～1.5％，优选为1.5％；lap光引发剂的质量浓度为0.5％；高碘酸钠的质量浓度为0.4％。

9、所述蓝光光照交联的时间可为10～60s，具体可为15～60s。

10、4-arm pegma通过包括如下步骤的方法制备得到：将四臂聚乙二醇(4-arm peg)在有机溶剂中，在碱性条件使用甲基丙烯酰氯处理过夜即得；

11、hama通过包括如下步骤的方法制备得到：配制透明质酸水溶液，ph值为8-9的条件下，使用甲基丙烯酰氯或甲基丙烯酸酐处理，即得，

12、其中，甲基丙烯酰氯或甲基丙烯酸酐与透明质酸的摩尔比可为5～7.5：1；

13、odoha通过包括如下步骤的方法制备得到：将ha先用高碘酸钠溶液氧化，得到氧化透明质酸(oha)，再将氧化透明质酸(oha)与盐酸多巴胺进行schiff碱缩合反应，得到odoha，

14、其中，ha与高碘酸钠的质量比可为1g：0.5～0.6g；所述氧化的温度可为室温，时间可为1-3h，具体可为2h；

15、oha与盐酸多巴胺的质量比可为1g：0.3～1.0g；

16、所述schiff碱缩合反应的温度为室温，时间可为6-12h，具体可为10h。

17、上述多巴胺透明质酸粘性水凝胶体系具有一定的力学强度和粘性，不具有细胞毒性，具有生物相容性。

18、上述多巴胺透明质酸粘性水凝胶体系在制备用于创伤修复、组织再生、结构支撑的材料中的应用也属于本发明的保护范围。

19、在前期的研究中，发明人所在实验室开发出了一种基于sf与ha的光交联水凝胶[sun m,cheng j,zhang j,et al.,stepwise cross-linking offibroin and hyaluronicfor 3dprinting flexible scaffolds with tunable mechanical properties[j].acsbiomater sci eng,2021,7(3):916-925]。这种水凝胶使用甲基丙烯酰化的ha与sf溶液混合，通过光交联和乙醇处理的方式形成凝胶。这种凝胶具有逐级交联的特点，表现出比传统凝胶体系gelma更好的力学强度、韧性以及抗降解性能。本发明在这一凝胶体系的基础上，在凝胶中掺入修饰了多巴胺的ha分子，开发出了一种新型的可注射式粘性水凝胶体系。由于凝胶体系可注射的特性，先前研究中乙醇处理的物理交联步骤无法进行，该体系因此而无法达到先前研究中表现出的力学强度。针对这一问题，本课题将丝素蛋白进一步地替换为甲基丙烯酸酯端基的四臂聚乙二醇(4-arm pegma)，再次开发出了一种新型的可注射式粘性水凝胶体系，该体系具有更好的力学特性和抗降解性能。

20、本发明还提供一种可注射式粘性水凝胶体系。

21、本发明所提供的可注射式粘性水凝胶体系，含有上述4-arm pegma/hama/odoha水凝胶体。

22、本发明具有以下有益效果：

23、首先，本发明所设计的两种凝胶材料具有一定的力学强度和粘性；其次，本发明所设计的两种材料通过了一系列的细胞毒性实验，并且应用在了动物实验当中，相比于现有技术，作为生物材料，有着更令人信服的生物相容性。

24、为验证材料在活体组织上的粘附力，并且评估材料的生物相容性，使用活体小鼠进行动物组织粘接实验。实验结果表明，脂肪垫与凝胶粘接的位置几乎没有出现蓝色的胶原纤维层，同时也间接说明凝胶材料不会引起组织炎症，提示了凝胶材料具有良好的生物相容性。