一种光热/化学动力协同红外/核磁共振成像纳米粒子的制备方法与流程

本发明涉及一种光热/化学动力协同红外/核磁共振成像的纳米粒子的制备方法，具体涉及一种以纳米金棒为光热治疗载体，同时以二氧化锰生成至纳米金棒表面为化学治疗基础并结合巨噬细胞膜包裹靶向传递的红外和核磁共振双模式成像的制备技术。本发明属于纳米生物医药材料领域。

背景技术：

1、癌症是全球死亡率和发病率中主要的因素，但癌症治疗技术的发展依旧落后于癌症的对人类造成的伤害。传统癌症治疗方法如手术治疗、化学治疗和放射治疗等技术存在治疗费用昂贵、对人体伤害大、治疗效果不佳等缺点。微创、高效、靶向已日益成为人们开发癌症诊断治疗技术的目标。光热力治疗（ptt）、光动力治疗（pdt）、化学动力治疗（cdt）等癌症治疗技术打开了癌症治疗的新思路，不过上述治疗方式在临床应用的局限限制了它们的发展。cdt治疗效果与肿瘤微环境结合的特点使其相较于其他治疗方式更具有选择性强、治疗逻辑性强、内源性强等优势。cdt主要缺点在于治疗过程生成羟基自由基较少，而热刺激可以加速反应速率。化学动力材料协同光热材料可以达到联合治疗的效果。另外，具用成像功能效果的材料在定位肿瘤部位、治疗监测上更加方便。当今计算机断层扫描技术（ct）、核磁共振成像技术（mrt）、光声成像技术（pa）、红外成像技术（ti）等多种成像方式增加了癌症检测定位的选择性。

2、在光热力治疗研究中，光热材料主要包括：金属材料（中国发明专利：一种刺状光热阳极材料及其在电芬顿体系中杀菌的应用，公开号：cn202310405905.6；中国发明专利：一种au-ceo-2光催化-光热复合材料及其制备方法和应用，公开号： cn202111040600.7；中国发明专利：一种光热金纳米材料的制备方法，公开号： cn201910401117.3）、碳材料（中国发明专利：一种空心碳球光热材料及其制备方法，公开号：cn201911426050.5；中国发明专利：碳点耦合聚多巴胺光热转化材料的制备方法，公开号：cn202110166713.5；中国发明专利：一种碳纳米管/铁网光热材料的制备方法及应用，公开号：cn202111171366.1）、半导体材料（中国发明专利：介孔硅负载氮掺杂石墨烯纳米复合材料在制备光热治疗牙周炎药物上的应用及制备方法，公开号：cn202210652132.7；中国发明专利：一种生物炭-氮化钛超疏水光热涂层材料及其制备方法，公开号：cn202111276816.3；中国发明专利：一种镍/碳化钛光热催化材料及其制备方法和应用，公开号：cn202110876121.2）等，其中金属材料的应用较为成熟。在化学动力治疗研究中，主要治疗材料有：过渡金属纳米材料（中国发明专利：一种光热化学动力纳米复合物及其制备方法与应用，公开号：cn202210515929.2；中国发明专利：一种中空结构的硒铜复合球状纳米颗粒及其制备方法与应用，公开号：cn202210513466.6）、金属有机纳米材料（中国发明专利：一种协同饥饿疗法/化学动力疗法增强抗肿瘤纳米药物的制备方法和应用，公开号：cn202210840566.x；中国发明专利：一种cu-fc mof纳米颗粒及其制备方法和应用，公开号：cn202210041245.3）等，其中过渡金属由于其良好的稳定性得到研究者青睐，但其在人体内的安全性仍须进一步研究。开发高效、稳定、无害的光热和化学动力材料仍然是研究的热点。在纳米递药系统，常见用于包裹的材料主要有：高分子材料（中国发明专利：一种脂质体包裹的表面修饰的微生物的制备方法，公开号：cn202211453316.7；中国发明专利：一种生物医学高分子材料包裹的放射性二氧化硅微球及其制备方法和应用，公开号：cn202211655675）和细胞膜（中国发明专利：一种生物膜包裹的载药蛋白纳米粒及其制备方法，公开号：cn202210797070.9；中国发明专利：一种细胞膜包被载药囊泡、制备方法及应用，公开号：cn202310190225.7），其中生物膜包裹由于其良好靶向性和生物安全性，常常用于药物的外部包裹。

3、传统的热红外成像研究中，红外成像物质主要包括：金属材料（中国发明专利：一种海胆状纳米金的制备方法及其在肿瘤成像及治疗中的应用，公开号：cn201710427814.7）和无机复合材料（中国发明专利：一种具有强红外热辐射碳基气凝胶复合材料的制备方法，公开号：cn202211333040.9）等，由于金属材料光热转化效率高而得到广泛研究；核磁共振成像物质主要为稀土材料（中国发明专利：一种球状稀土团簇及其制备方法和在制备核磁共振成像造影剂中的应用，公开号：cn202111267040.9）、超顺磁性氧化铁（中国发明专利：具有核磁共振成像与干细胞保护功能的超顺磁颗粒-钴原卟啉自组装体及其制备方法，公开号：cn202010524508.7）、钆螯合物（中国发明专利：il-13修饰的含钆螯合物脂质体靶向磁共振成像对比剂及其制备方法和应用，公开号：cn201510319595.1）等。虽然有研究表明这些物质大部分具有微量的细胞毒性和较高的人体体外安全性，但是在人体内循环安全性仍然需要进一步的验证。因此，开发体内安全、定位精确、高效的成像材料仍是研究的热点。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种光热/化学动力协同红外/核磁共振成像纳米粒子的制备方法。

2、本发明目的通过下述方案实现：发明采取晶种子生长法，在十六烷基三甲基溴化铵（ctab）模板剂的基础合成纳米金棒，通过高锰酸钾（kmno4）和聚烯丙基胺盐酸盐（pah）氧化还原，共同作用制备二氧化锰负载的纳米金棒（aunrs@mno2）。进一步地，通过培养巨噬细胞提取细胞膜，在脂质体挤出仪作用下，将巨噬细胞膜包裹至aunrs@mno2表面，即可得到具备红外/磁共振成的光热协同热增强化学动力的aunrs@mno2-raw纳米粒子，包括下述步骤：

3、（1）纳米金棒溶液的制备：

4、第一步种子液的制备：ctab溶液在匀速搅拌下加入500μl的 haucl4溶液或其盐溶液。当溶液颜色由无色变为亮黄色时，快速加入少许0度的还原剂，如nabh4溶液；观察溶液变为暗褐色时，继续搅拌5-10 min，得到种子液静置待用；第二步准备生长液：将足量ctab溶液、haucl4或其盐溶液、银盐溶液（如agno3），1.6ml的hcl溶液按顺序加入到反应仪器中，生长液变为亮黄色后，将少量的抗坏血酸溶液缓慢逐滴加入到生长液中；最后，将种子液加入到生长液中，继续搅拌2min，静置12h，之后离心洗涤2次，得到纯净的纳米金棒溶液（aunrs）；

5、（2）二氧化锰负载纳米金棒的制备：

6、取制备好的au nrs溶液，加入分子量为2000的mpeg-sh，经过5 min的超声混合均匀后，继续反应2-3 h；离心去除溶液中多余的m peg-sh；aunrs在经过表面配体交换之后用来进行外层mno2的负载，得到表面修饰后的aunrs；将所述的表面修饰后的aunrs离心，重新分散于去离子水中，加入kmno4粉末搅拌15min，待kmno4充分溶解后，逐滴加入分散于去离子水中的pah溶液，溶液颜色由黑棕色变成浅棕色，该溶液静置2h；将所得溶液离心，冷冻干燥过夜，得到二氧化锰负载纳米金棒纳米颗粒（aunrs@mno2）；

7、（3）巨噬细胞培养和巨噬细胞膜提取

8、培养永生化的巨噬细胞系raw264.7收获作为巨噬细胞膜来源，巨噬细胞培 养在含10% fbs、100u/ml青霉素-链霉素混合溶液的高糖dmem培养基中,待巨噬细胞成长至一定数量后进行细胞膜提取；将收集的细胞悬液在冰上重悬，稀释到合适细胞数量浓度，tmbuffer 加1%体积的pmsf低渗孵育过夜；随后，使用超声波细胞破碎仪在180w功率下冰浴破碎细胞膜，得细胞匀浆；接着，向细胞匀浆中加入适当浓度蔗糖溶液；将收集细胞悬液于4℃、2000 g条件下离心15 min，弃去沉淀收集上清，重复离心一次弃去尚未完全分离掉的细胞核细胞器等结构，将收集到的上清在4℃、3000 g 条件下离心收集沉淀即为巨噬细胞膜；将收集到的巨噬细胞膜用冰tm buffer洗一遍后离心收集得到进一步纯化的巨噬细胞膜，冷冻干燥后于-80度冻存；

9、（4）巨噬细胞膜包裹二氧化锰负载纳米金棒：

10、取制备的aunrs@mno2材料与提取的巨噬细胞膜按一定的比例混合均匀，在脂质体挤出仪内依次通过400 nm、200 nm、100nm的聚碳酸酯膜共挤，来回挤压15次，pbs离心洗涤，最终制得的aunrs@mno2-raw纳米材料，于-80度保存、备用。

11、本发明步骤（1）中，所述的还原剂可以为硼氢化钾（kbh4），硼氢化钠（nabh4），硼氢化钙（ca（bh4）2）、硼氢化锂（libh4）、和锂铝氢化物（lialh4）中的一种。

12、本发明步骤（1）中，所述的氯金酸盐为氯金酸钾（kaucl4）和氯金酸钠（naaucl4）、三氯化金（aucl3）和氯化亚金（aucl）的一种。

13、本发明步骤（1）中，所述的银盐可以为硝酸银 （agno3）、氟化银（agf）、氯酸银（agclo3）和高氯酸银（agclo4）一种。

14、本发明的优点在于：

15、（1）本发明制备的aunrs@mno2-raw纳米材料具备优越的光热性能，在近红外光的照射下可以造成肿瘤的死亡，高热量可以刺激mn2+引发的类芬顿反应，同时二氧化锰被肿瘤区域过表达的谷胱甘肽还原为mn2+，催化肿瘤区域过表达的过氧化氢为强氧化破坏能力的羟基自由基，从而增强化学动力治疗效果。

16、（2）本发明制备的aunrs@mno2-raw纳米材料的外壳层二氧化锰具备肿瘤微环境响应的磁共振成像和金元素的红外成像效果，具有良好的物理化学稳定性、热红外成像和磁共振成像性能。

17、（3）本发明中的aunrs@mno2-raw纳米材料具有良好的靶向性，生物毒性小，制备的方法工艺简单，可操作性强。