一种眼部跨角膜屏障的蛋白质药物递送纳米颗粒与应用的制作方法

本发明涉及蛋白质药物递送，具体涉及一种眼部跨角膜屏障的蛋白质药物递送纳米颗粒与应用。

背景技术：

1、相比于传统小分子药物，蛋白质疗法拥有其突出的优点：较高的特异性、较长的药物半衰期、产生多种药物耐药性的可能性较低、对除病灶细胞以外的正常细胞造成的毒副作用少、蛋白质药物不容易引起机体对其免疫反应以及具有较高的生物安全性等。但是蛋白质由于其自身的特点，例如具有比较大的尺寸、较高的分子量、较好的亲水性以及分子表面有限的正电荷效应等使得其透过生物膜的可能性非常小，游离蛋白质跨越生物屏障能力有限，这给酶降解和免疫清除提供了足够的时间，最终导致非常低的生物利用度。膜不渗透性和穿透屏障能力差使得蛋白质疗法一直局限于细胞膜外的治疗靶点很难透过细胞膜以及类似于眼前节中角膜的生理屏障进而作用于细胞质和屏障内病灶处的治疗靶点。目前，fda批准的蛋白质药物基本上是针对细胞外靶点包括膜相关蛋白和细胞分泌蛋白，细胞内靶点所引发的疾病较少的被涉及到，但据统计有超过70%的基因组编码蛋白质位于细胞内。

2、难以穿透屏障组织造成的药物低生物利用度导致频繁给药以达到预期的治疗效果，尤其在眼科滴眼液的使用中这一点表现尤为突出，进而导致患者出现依从性差和巨大的经济负担。显然，有效地将蛋白质通过生物屏障输送到特定的位置是一个迫切需要解决的问题。

3、角膜的无血管特性确保其透明性从而保证视力的正常。眼睛作为人类最重要的器官之一，人眼接受的外界信息占人类大脑接收到的外部信息的80%以上，其独特的解剖和生理结构使其造成一些生物屏障。滴眼液是临床上治疗大多数眼前节疾病最常用的给药方法，因为其方便且患者依从性好。但由于眼前段存在各种生物屏障，包括结膜屏障、泪膜屏障和角膜屏障，即使对于大多数小分子药物，药物的总体生物利用度仍低于5%。因此，治疗眼前节疾病的关键挑战是药物如何穿过这些生物屏障进入眼睛。在眼部的 生物屏障中，角膜被通常认为是最主要的屏障。

4、角膜新生血管（cnv）通常发生在各种各样的角膜病变中，如化学烧伤、创伤、感染性角膜炎、与隐形眼镜相关的缺氧、炎症性疾病、角膜移植排斥反应、角膜缘干细胞缺乏、过敏、先天性疾病和自身免疫性疾病等。与cnv相关的疾病影响着数百万人的日常生活。其治疗方法众多，例如抗炎药物， vegf拮抗剂，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，mmp）抑制剂以及手术治疗。其中，vegf拮抗剂在近年来的研究中受到了广泛关注，并且在一些实验性研究和临床试验中都显示了其对于角膜新生血管较好的治疗效果。贝伐单抗，一种新型人源化抗血管内皮生长因子的重组鼠单克隆抗体, 分子量为149 kda，可与vegf-a的5种亚型结合，竞争性抑制内源性vegf，从而抑制新生血管的生长。然而，由于上述眼部生物屏障存在，通常此类结膜下给药后生物制剂的生物利用度低于10%。

5、所以，在将大分子蛋白质药物应用到角膜新生血管治疗时，仍然需要一种能够穿透屏障的递送药物，可以提高眼部蛋白质药物的生物利用度，达到更好的治疗效果，减少多次重复用药以及缓解患者的经济负担。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的技术缺陷，本发明提供一种眼部跨角膜屏障的蛋白质药物递送纳米颗粒与应用，将大分子蛋白质药物滴注于眼部以治疗角膜新生血管，提高了眼部蛋白质药物的生物利用度，保证了制备过程中贝伐单抗的高活性。

2、本发明采用的技术解决方案是：一种眼部跨角膜屏障的蛋白质药物递送纳米颗粒，所述的蛋白质药物递送纳米颗粒为蛋白质药物与金属离子通过配位相互作用结合形成蛋白质纳米颗粒，蛋白质纳米颗粒同时静电作用结合树枝状大分子。

3、所述的蛋白质药物为抗血管内皮生长因子药物。

4、所述的抗血管内皮生长因子药物为包括天然存在的免疫球蛋白或其功能片段、人源化抗体或其功能片段、抗体融合蛋白中的一种或几种。

5、所述的抗血管内皮生长因子药物为贝伐单抗。

6、所述的金属离子为锌离子。

7、所述的树枝状大分子为氨基封端的第四代pamam(g4)，g4通过静电相互用吸附于上述蛋白质纳米颗粒内部或者表面

8、所述的蛋白质药物递送纳米颗粒中蛋白质药物与金属离子的质量比为5~9:1，蛋白质药物与树枝状大分子的质量比为8~12:1。

9、所述的蛋白质药物载于所述的蛋白质纳米颗粒内部或者吸附于表面，包封率至少为95%。

10、所述的纳米颗粒对蛋白质药物的释放具有ph响应性，在ph=6~8时，对所述大分子药物释放持续至少10天。

11、一种眼部跨角膜屏障的蛋白质药物递送纳米颗粒在制备具有穿透角膜屏障递送的抗血管新生药物上的应用。

12、所述的抗血管新生药物为滴眼液，所述滴眼液制剂所包含组分及配比如下：

13、蛋白质药物 1.5~5 mg/ml；

14、氨基封端的第四代pamam(g4)型号为cyd-140a0.16~0.54 mg/ml；

15、锌离子 0.18~0.6 mg/ml；

16、聚乙烯吡咯烷酮 10~15mg/ml；

17、缓冲盐4~6mg/ml；

18、并调节所述制剂ph至7~9；

19、所述缓冲盐为hepes-na；

20、所述制剂采用ph调节剂调节ph，所述ph调节剂为盐酸/氢氧化钠缓冲对。

21、所述的滴眼液通过以下步骤制备：

22、（1）将蛋白质药物与g4和聚乙烯吡咯烷酮共同溶解于含有缓冲盐的溶液中；（2）调节ph至7-9，在4℃水浴超声条件下，将锌离子缓慢逐滴加入到上述反应溶液中，溶液由澄清透明变为乳白色；

23、（3）超声下反应30 min后，通过4℃低温离心12000 rpm*10 min、超纯水洗涤、超声下用超纯水重新分散得到纳米颗粒；

24、（4）4 ℃冰箱保存备用，使用前超声3 min。

25、本发明的有益效果是：本发明提供了一种眼部跨角膜屏障的蛋白质药物递送纳米颗粒与应用，纳米颗粒的合成过程温和，在ph=8这一近似生理ph值条件下合成，不进行复杂的各种加成反应和复杂基团的引进，不涉及具有毒性的有机试剂，载体具有纳米级尺寸，分散性良好，不会造成眼部不适感，具有良好的生物相容性，对眼部不产生额外刺激，载体呈恰当的正电位，可与角膜上呈负电位的泪膜粘蛋白产生静电吸引作用而增加药物在眼部的滞留时间，纳米颗粒对贝伐单抗的包封率相比于其它以“载体”形式包载贝伐单抗的研究，本发明的纳米颗粒对贝伐单抗的包载效率较高，最低可达95%，纳米颗粒具有ph响应性，对于所载蛋白质药物，在酸性条件下（ph=4.5）突释，在ph=6~8时，对所述大分子药物释放持续至少10天，以缓释的方式将药物在眼部的浓度维持在治疗范围而提高生物利用度，合成的纳米颗粒具有非常好的抗体内生物酶剪的切能力，可以较好的适应进入生物体内后的环境，可以保护其中的蛋白抗体药物不失活，纳米颗粒由于含有g4，其上的表面氨基基团产生的“质子海绵效应”让本发明的纳米颗粒具有打开角膜上皮紧密连接进行角膜渗透和溶酶体逃逸的特点，本发明的纳米颗粒具有高效穿透角膜屏障的效果，实现了帮助蛋白质药物穿透屏障，高效的溶酶体逃逸有效保护了蛋白质药物的活性，从而保证其在角膜基质层的有效浓度而发挥药效。