放射性核素标记的1B50-1抗体及其制备方法和应用

本发明属于医药制品，具体涉及一种放射性核素标记的1b50-1抗体，及其制备方法，以及所述抗体在癌症诊断、预测疗效和评价预后方面的应用。

背景技术：

1、在肿瘤复发耐药的机制研究中，肿瘤干细胞(cancer stem cell，csc)学说取得了一系列成果。csc学说认为，肿瘤组织的细胞呈等级分布，是由肿瘤干细胞通过不对称分裂和不断分化所形成，肿瘤干细胞是肿瘤异质性产生的起源细胞。肿瘤干细胞是肿瘤组织中少数具有无限自我更新能力、能驱动肿瘤形成和生长的一类细胞。

2、1994年，lapidary t等人发现的具有cd34+cd38-表型的人急性髓性白血病干细胞是人类恶性肿瘤干细胞，首次报道了肿瘤干细胞的存在，其后陆续有研究者证明多种实体瘤中存在csc。csc常表现为耐药、体内有强的致瘤性、多向分化潜能、自我更新能力强，对肿瘤放化疗抗性的产生和肿瘤的复发起关键作用。csc的提出，为晚期恶性肿瘤的治疗及预后评估提供了可靠的生物学指标。

3、分子影像诊断技术以人全身为探查对象，将肿瘤影像诊断提高到肿瘤细胞特异性表达的分子水平。2003年，herschman教授在science杂志上发文指出，通过分子影像能够观察到问题，从而获得解决问题的方法。目前已应用于临床肿瘤干细胞的分子影像学成像主要包括核磁成像(mri)、核医学成像(pet/spect)、光学成像等。核医学显像特别是正电子发射断层显像术(positron emission tomography，pet)是一种无创、高灵敏的检测手段，鉴于肿瘤干细胞在肿瘤复发、转移和耐药形成中的关键作用，靶向肿瘤干细胞有可能成为干预肿瘤进程的新的有效方法。事实上，以肿瘤干细胞探测为目的的新型分子影像探针已经显示出其在肿瘤预后评价中的优势。niedermann等人开发出具有cd133+肿瘤干细胞特异性的pet探针64cu-nota-ac133，进一步生物学评价表明该探针能够特异性、高灵敏度地探测cd133+肿瘤干细胞。基于cd133+特异性pet探针的成功研发，进一步证实了分子显像在肿瘤干细胞诊断中的广阔应用前景。目前，cd133+特异性pet探针主要用于开展针对人脑胶质瘤干细胞的研究。

4、仍需要开发能够进行其他肿瘤干细胞检测，以推进肿瘤早期发现以及肿瘤预后评价。以肝癌为例，目前肝癌检查主要包括血清甲胎蛋白(afp)和肝脏影像学检查。afp检查是目前常用的，也最简单的方法，但其敏感度、特异性较低。约40％的肝癌患者呈afp阴性，在妊娠妇女、急慢性肝炎、生殖腺肿瘤和胃肠道肿瘤等人群中afp亦可升高。常规影像学方法如b超、ct及mri可以清晰显示病变的解剖结构和毗邻关系，但探测灵敏度有限，难以实现分子水平的靶向性探测。如b超在检查直径<1.0cm的结节时，灵敏度仅有34％。因此，发展基于肿瘤干细胞的特异性检查手段，对肿瘤的诊断与治疗非常重要。

技术实现思路

1、本发明涉及对1b50-1及1b50-1-f(ab’)2抗体结构进行修饰之后，用放射性核素64cu标记的制备方法及使用方法。

2、本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

3、本发明提供一种放射性核素标记的抗体，所述抗体是能特异结合cacna2d1(电压依赖性钙离子通道蛋白α2δ亚基1)的抗体或抗原结合片段，所述放射性核素是64cu，所述放射性核素通过双功能螯合剂标记于所述抗体上。

4、在本发明的一些实施方式中，放射性核素标记的抗体，其中双功能螯合剂与抗体的摩尔比大于等于1，优选为(1-10):1，更优选为(3-5):1，每个双功能螯合剂螯合一个放射性核素。

5、在本发明的一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列分别如seq no.1、seq no.2和seq no.3所示的重链可变区互补决定区cdrh1、cdrh2和cdrh3，以及氨基酸序列分别如seq no.4、seq no.5和seq no.6所示的轻链可变区互补决定区cdrl1、cdrl2和cdrl3。

6、在本发明的一个实施方式中，所述抗体或抗原结合片段是由保藏编号为cgmccno.4416的杂交瘤细胞系所分泌的单克隆抗体1b50-1。

7、在本发明的一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段是所述抗体的fab或f(ab’)2片段。

8、在本发明的一个实施方式中，所述抗体或抗原结合片段是单克隆抗体1b50-1的f(ab’)2片段。

9、双功能螯合剂包含与所述抗体上的氨基、羧基、羰基或硫醇官能团形成共价键的反应基团。在本发明的一些实施方式中，所述双功能螯合剂是nota类化合物或dota类化合物。

10、在本发明的一个具体实施方式中，所述双功能螯合剂是ncs-bz-nota(2-[(4-异硫氰基苯基)甲基]-1,4,7-三氮杂环九烷-1,4,7-三乙酸)。

11、在本发明的一个具体实施方式中，所述放射性核素标记的抗体中，所述放射性核素是64cu，所述抗体是单克隆抗体1b50-1，所述双功能螯合剂是ncs-bz-nota，双功能螯合剂通过其ncs-基团与抗体上的氨基偶联，通过nota结构螯合放射性核素，双功能偶联剂与抗体的摩尔比大于等于1，优选为(1-10):1，更优选为(3-5):1，每个双功能偶联剂螯合一个放射性核素。为方便行文，所述放射性核素标记的抗体又表示为“64cu-nota-1b50-1”。

12、在本发明的一个具体实施方式中，所述放射性核素标记的抗体中，所述放射性核素是64cu，所述抗体是单克隆抗体1b50-1的f(ab’)2片段，所述双功能螯合剂是ncs-bz-nota，双功能螯合剂通过其ncs-基团与所述抗体片段上的氨基偶联，通过nota结构螯合放射性核素，双功能偶联剂与抗体的摩尔比大于等于1，优选为(1-10):1，更优选为(3-5):1，每个双功能偶联剂螯合一个放射性核素。为方便行文，所述放射性核素标记的抗体又表示为“64cu-nota-1b50-1-f(ab’)2”。

13、本发明还提供所述放射性核素标记的抗体的制备方法，其包括在碱性条件下，用双功能螯合剂修饰抗体得到待标记前体，在弱酸性条件下，将放射性核素与待标记前体进行反应，得到放射性核素标记的抗体。

14、根据本发明，所述碱性条件为ph 8.8-9.3。可以采用本领域中常规的能提供所述ph条件的缓冲体系。在本发明的一些实施方案中，使用nahco3缓冲液，例如用0.09-0.11m的nahco3溶液和0.09-0.11m的na2co3按照适当比例混合，以提供ph8.8-9.3的碱性条件。

15、根据本发明，用双功能螯合剂修饰抗体时，使用的抗体与双功能螯合剂的摩尔比为1:2-25。在本发明的一些实施方式中，当双功能螯合剂为nota类化合物时，所述抗体与双功能螯合剂的摩尔比优选为1:3-11，例如1:3，1:3.5，1:4，1:4.5，1:5，1:5.5，1:6，1:6.5，1:7，1:7.5，1:8，1:8.5，1:9，1:9.5，1:10，1:10.5，1:11等。

16、根据本发明，双功能螯合剂修饰抗体时的反应温度为37-41℃，反应1-4h。

17、根据本发明，所述弱酸性条件优选为ph为5.0-6.0。在本发明的一些实施方式中，当双功能螯合剂为nota类化合物，所述弱酸性条件优选为ph为5.5-6.0。

18、根据本发明，放射性核素与待标记前体的反应温度为32-42℃，例如37-41℃。

19、根据本发明，所述抗体在进行修饰和标记前，用色谱柱进行纯化。优选纯化温度低于42℃。

20、根据本发明，所述放射性核素标记的抗体制备得到后，用色谱柱进行分离纯化。

21、在本发明的一个实施方式中，所述色谱柱是pd-10。

22、在本发明的一个具体实施方式中，64cu-nota-1b50-1或64cu-nota-1b50-1-f(ab’)2的制备方法包括：配置ph 8.8-9.3的nahco3缓冲液(例如用0.09-0.11m的nahco3溶液和0.09-0.11m的na2co3按照适当比例混合)，将1b50-1或1b50-1-f(ab’)2溶液中的溶剂置换为所述nahco3缓冲液，按照抗体与双功能偶联剂的摩尔比为1：3-11，在37-41℃，ph 8.8-9.3下，反应1-4h，进行双功能偶联剂ncs-bz-nota修饰，得到相应的标记前体nota-1b50-1或nota-1b50-1-f(ab’)2。向1-5mg/ml的nota-1b50-1或nota-1b50-1-f(ab’)2溶液中加入0.09-0.11m的naac溶液和120-12000mbq/ml(优选为3000-5000mbq/ml)的64cucl2溶液；将ph调至5.5-6.0，37-41℃反应20-40min，用色谱柱分离纯化，得到64cu-nota-1b50-1或64cu-nota-1b50-1-f(ab’)2。

23、本发明还提供所述放射性核素标记的抗体在制备肿瘤诊断试剂中的用途。

24、在本发明的一个实施方式中，所述肿瘤诊断试剂是肿瘤核素显像试剂，优选为pet正电子显像试剂。

25、所述放射性核素标记的抗体制备的显像试剂能够对肿瘤干细胞进行显像，本技术发明人研究发现，其在原发肿瘤、肿瘤体积很小阶段即可显像，与核素标记的其他靶向肿瘤干细胞的抗体相比，灵敏性更高，可用于肿瘤的早期检测和诊断、早期肿瘤或原位癌的检测和诊断、肿瘤治疗效果的分析和判断(检测治疗后的肿瘤中肿瘤干细胞存在与否，数量多少等)，肿瘤预后的评估分析(检测肿瘤中肿瘤干细胞存在与否，数量多少等)。

26、根据本发明，所述肿瘤包括但不限于肝癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌等；优选为肝癌。

27、本发明还提供一种pet正电子显像用药物组合物，其包含本发明所述的放射性核素标记的抗体。在本发明的一个实施方式中，所述药物组合物中含有30-100mbq/ml的放射性活度。

28、本发明还提供一种肿瘤诊断方法，其对有需要的患者给予适当量的本发明所述的放射性核素标记的抗体。在本发明的一个实施方式中，所述适当量的本发明所述的放射性核素标记的抗体提供10-100mbq的放射性活度。

29、本发明中的序列：

30、seq no.1：thr ser gly met gly val ser

31、seq no.2：gln ile tyr trp asp asp asp lys arg tyr asp pro ser leu lysser

32、seq no.3：arg gly thr gly thr phe pro asp val

33、seq no.4：arg ala ser gln ser ile gly thr ser ile his

34、seq no.5：tyr ala ser asp ser ile ser

35、seq no.6：leu gln thr asn ser trp pro trp。

36、本发明中优选的抗体或抗原结合片段，单克隆抗体1b50-1在中国专利cn103562403b中已公开，所述cn103562403b的全文引入本技术中。

37、64cu具有较长的半衰期(t1/2＝12.7h)，利于放射性核素的长途运输和储存；中长半衰期既满足了有效时间内对病灶的检出，也减少了患者体内放射性的累积；64cu(β+：0.653mev，17.4％；β-：0.578mev，39％)利用其β+衰变产生的511kev光子，可以进行pet正电子显像。双功能螯合剂ncs-bz-nota中含有的3个氮原子及羧酸根上的3个氧原子易与64cu形成稳定的配位结构，在体内更加稳定。