PHLPP1及其相关物质在治疗肺纤维化中的应用

本发明涉及生物医药，具体涉及1型蛋白磷酸酶pleckstrin同源序列富亮氨酸重复片段蛋白磷酸酶1(phlpp1)作为靶点在制备治疗肺纤维化尤其特发性肺纤维化药物中的应用，还涉及包含其的载体和药物组合物。

背景技术：

1、纤维化疾病是导致死亡的重要原因，无论是毒素、遗传、肿瘤、感染性及自身免疫性相关，还是特发性的，对任何器官的功能都会产生影响。肺纤维化(pulmonary fibrosis，pf)，是一种由反复肺损伤和炎症驱动的慢性进行性病理变化，中位生存期只有3年。尽管现在小部分抗纤维化治疗药物能够减缓pf的进展，但因对其病因的了解不足，目前仍缺乏有效逆转肺纤维化的干预手段。因此，阐明肺损伤后肺纤维化的发生发展及关键调节机制对于开发药物手段以阻止肺损伤后肺纤维化及肺功能衰竭有着重要的临床意义。

2、肺成纤维细胞是肺纤维化最重要的效应细胞，在肺泡和间质中产生大量的细胞外基质(extracellular matrix，ecm)。肺成纤维细胞的分化和活化是由肺泡上皮细胞和免疫细胞释放的各种细胞因子和生长因子触发和维持的。在免疫细胞中，肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages，ams)与活化的肌成纤维细胞互作，可引发慢性炎症和pf。ams位于气道内，由单核细胞分化(mo-ams)或组织驻留(tr-ams)的巨噬细胞局部增殖发育而来，其中髓系来源的巨噬细胞是影响肺损伤后组织慢性炎症和肺纤维化的重要细胞类型。肺组织损伤时，巨噬细胞迁移到损伤部位，并根据微环境的刺激信号不同，分化为不同表型和功能的巨噬细胞，即具有促炎表型的m1和促纤维化表型的m2，m1/m2表型的平衡决定了肺组织在炎症或损伤后的命运。在肺组织损伤炎症早期，ams被募集到损伤部位并倾向于m1极化，炎症因子的分泌大量增加，如tnf-α、il-1β、no、ros等诱导组织发生过度的炎症反应，导致肺组织损伤加重。随着损伤的进展，m2型巨噬细胞比例显著增加，并分泌重要的纤维增生调节因子参与组织修复和愈合；但进展到慢性炎症期时，m2型巨噬细胞在肺组织中过度浸润，会导致血管生长因子、基质金属蛋白酶等ecm成分大量累积，引起肺组织异常修复、血管重构，触发纤维化。综上所述，ams既能通过m1型极化参与介导肺组织的炎症损伤，也能通过m2型极化介导纤维化瘢痕组织的形成。因此，精确调控肺损伤后巨噬细胞的极化状态将直接影响到肺损伤后的病理归宿，而阐明巨噬细胞极化的关键调控机制则尤为重要。

3、phlpp1(pleckstrin homology domain leucine-rich repeat proteinphosphatase 1)，又称scop或ppm3a或plekhe1，属于蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶家族成员，phlpp1已证实能直接去磷酸化akt、蛋白激酶c(pkc)以及s6激酶(s6k)等蛋白的相应保守位点，从而调控细胞的多种生物学功能。目前有关phlpp1的研究多聚焦在其靶分子akt。phlpp1去磷酸化akt降低调节性t细胞受体信号转导活化，影响t细胞发育，或去磷酸化stat1，调控巨噬细胞的吞噬作用，进而参与炎症免疫反应。此外，phlpp1缺陷通过上调akt的活化能够减轻心脏和大脑的缺血损伤，但是，phlpp1在肺纤维化中的作用尚不清楚。

4、综上所述，本领域迫切需要开发新的缓解和治疗肺纤维化的策略，抑制肺损伤后肺纤维局部微环境中的免疫细胞功能改变和致病效应，控制其所导致的纤维化及其相关症状和/或其它并发症。

技术实现思路

1、本发明针对上述问题进行，首先确认phlpp1异常表达与肺纤维化的关系，然后基于该靶点观察phlpp1表达改变对肺纤维化病理及m2巨噬细胞极化的影响，进而确定phlpp1在肺纤维化进展中的作用。

2、本发明的研究过程如下：

3、发明人通过对公开数据库中特发性肺纤维化患者的肺组织和肺泡灌洗液巨噬细胞的数据进行挖掘分析，并将其与健康人进行差异基因分析，发现phlpp1的表达在肺纤维化病人中显著下降，且与肺纤维化的严重程度呈负相关，提示phlpp1可能与肺纤维化的发生有关。

4、之后采用loxp-cre系统敲除小鼠髓系细胞中的phlpp1，发现在phlpp1髓系细胞敲除小鼠的肺纤维化模型中，肺组织纤维化反应显著加重，肺组织中胶原大量沉积。phlpp1缺陷促进肺泡巨噬细胞向m2型转化，其培养上清能促进共培养体系里肺成纤维细胞中纤维化基因的表达。通过采用特异性小干扰rna靶向沉默phlpp1的表达，可以在骨髓来源巨噬细胞中上调m2型巨噬细胞标志基因表达；而在骨髓来源巨噬细胞中过表达phlpp1，则能抑制m2型巨噬细胞的标志基因表达。因此，我们得到结论，肺泡巨噬细胞中phlpp1的表达显著降低，促进了其向m2型巨噬细胞的转化，并上调促纤维化基因的表达，促进肺成纤维细胞的活化及纤维化效应，在肺纤维化疾病的进展中发挥重要作用。

5、基于上述研究，本发明的具体技术方案如下：

6、本发明的第一方面，提供了phlpp1促进剂在制备治疗肺纤维化及其相关症状及/或其它并发症药物中的用途。

7、其中，肺纤维化，包括特发性肺纤维化，其病理特点为肺部炎症导致肺泡持续性损伤及细胞外基质的反复破坏、修复、重建和过度沉积，而肺成纤维细胞激活会在肺泡和间质中产生大量的细胞外基质，并使肺部气囊(肺泡)周围和之间的组织变厚，这使得氧气更难进入血液，导致不可逆的肺功能下降，甚至呼吸衰竭。

8、优选的，phlpp1促进剂选自如下情形的任意一种或多种：外源性phlpp1蛋白或编码其的核酸、促进phlpp1蛋白表达或活性功能的物质、促进编码phlpp1蛋白的核酸分子过表达的物质、包裹phlpp1编码核酸的脂质体或纳米材料、能够在体内转化为phlpp1的前体蛋白或其偶联物或复合物。

9、进一步优选，phlpp1蛋白选自如下任一情形：

10、(a)、具有seq id no.2所示氨基酸序列的多肽；

11、(b)、具有seq id no.2所示氨基酸序列同源或具有序列同性(例如80％以上同源或具有80％以上序列相同性，如80％、85％、90％、95％、98％、99％)，且具有抑制纤维化反应和治疗肺纤维化及其相关症状及/或其它并发症的蛋白质或多肽；

12、(c)、(a)或(b)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸、且具有抑制纤维化反应和治疗肺纤维化的蛋白质或多肽，或由(a)或(b)衍生的蛋白质或多肽，编码phlpp1蛋白的核酸分子选自如下任一情形

13、(i)具有seq id no.1所示核苷酸序列的核酸分子；

14、(ii)在严格条件下与(i)限定的核苷酸序列杂交的分子；

15、(iii)与seq id no.1所示的核苷酸序列同源或具有序列相同性，且编码具有抑制纤维化反应和治疗肺纤维化及其相关症状的蛋白质或多肽的核酸分子；

16、(iv)由(i)、(ii)或(iii)中的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，且编码具有抑制纤维化反应和治疗肺纤维化及其相关症状或其它并发症的蛋白质或多肽的核酸分子。

17、本发明的第二方面，提供了一种phlpp1重组载体，重组载体包括表达载体以及插入设置在该表达载体上的编码phlpp1蛋白的核酸分子，编码phlpp1蛋白的核酸分子如上所述。

18、本发明第三方面，提供了phlpp1促进剂重组载体在制备治疗肺纤维化及其相关症状及/或其它并发症药物中的用途。

19、所述的载体包括病毒载体和非病毒载体。

20、所述的“病毒载体”，包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、柯萨奇病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、细小病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、痘苗病毒与水疱性口炎病毒等。合适的病毒载体是本领域普通技术人员所熟知的。

21、所述的“非病毒载体”，包括脂质体或脂类复合物、阳离子多聚物、壳聚糖聚合物及纳米粒子载体等。合适的非病毒载体是本领域普通技术人员所熟知的。

22、本发明的第四方面，提供了一种治疗肺纤维化及其相关症状及/或其它并发症的药物组合物，包括活性组分以及医学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。其中，所述活性组分为上所述的phlpp1促进剂或phlpp1重组载体。

23、本发明的重组病毒和药学上可以接受的辅料一起组成治疗肺纤维化及其相关症状及/或其它并发症的药物组合物，从而更稳定地发挥疗效。

24、药物形式方面，适于通过选自下组方式给予的药物或药物组合物：口服、注射(例如直接裸dna或蛋白质注射法、脂质体包裹dna或mrna注射法)、金包被基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒dna法、复制缺陷腺病毒携带目的dna法或目的基因所编码蛋白质、电致孔、鼻腔给药、肺部给药、口服给药。雾化吸入给药。

25、通常情况下，液体制剂可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，冻干制剂在30℃至少六个月保持稳定。制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂。

26、本发明中的组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重、疾病特性和严重性、以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。

27、进一步，本发明的药物组合物可和其他治疗肺纤维化及其相关症状及/或其它并发症的药物组合物联用。

28、本发明的第五方面，提供了检测phlpp1表达水平的试剂在制备肺纤维化检测试剂盒或药物筛选试剂盒中的应用。

29、实验结果显示phlpp1的表达在肺纤维化病人中显著下降，且与胶原纤维基因的表达呈负相关。phlpp1敲除促进了小鼠肺纤维化的发生发展，提示phlpp1是肺纤维化的保护因子，具有抑制纤维化反应的作用。据此可推断phlpp1可作为肺纤维化的诊断标志物或药物筛选标志物。

30、以phlpp1作为标志物进行药物筛选的方法如下：

31、(a)用候选物质处理肺纤维化或模拟肺纤维化反应或其他纤维化环境下的细胞、组织或动物；

32、(b)检测所述细胞、组织或动物中phlpp1或编码该蛋白质的核酸分子的水平；以及

33、(c)若phlpp1或编码该蛋白质的核酸分子的水平高于候选物质处理前的水平或高于正常对照中的水平，则表明所述候选物质具有通过促进phlpp1来治疗肺纤维化的作用。

34、本发明的第六方面，提供了一种肺纤维化诊断试剂盒或药物筛选试剂盒，该试剂盒包含了检测生物样品中phlpp1表达水平的试剂，由逆转录系统、引物系统和扩增系统组成。通过检测phlpp1的核酸表达水平，实现诊断或药物筛选。

35、本发明的有益保障及效果：

36、本发明提供了phlpp1促进剂在制备治疗肺纤维化及其相关症状及/或其它并发症药物中的用途，通过实验证实，phlpp1敲除促进了小鼠肺纤维化的发生发展，增强了肺部微环境中的促纤维化巨噬细胞的m2型转化和浸润，提示phlpp1是肺纤维化的保护因子，具有纤维化反应的抑制作用。phlpp1过表达能够抑制促纤维化巨噬细胞的活化，表现为抑制巨噬细胞中arg1、retnla、tgf-β的产生，从而实现肺纤维化的缓解和治疗。因此本发明针对phlpp1的过表达或功能促进为肺纤维化尤其特发性肺纤维化的治疗提供了新的靶点，具备广阔的临床应用前景。