一种人源生物角膜基质的制备方法和应用

本发明属于组织工程和再生医学领域，具体涉及一种人源生物角膜基质的制备方法和应用。

背景技术：

1、中国角膜病致盲者约500万，仅次于白内障，居眼科致盲疾病的第二位，约80％的患者可通过角膜移植恢复视力。但由于我国传统观念和眼库条件的限制，人供体角膜严重短缺，仅少数患者从中获益。同时，我国每年完成角膜屈光手术约100万例，激光切割取下的人角膜基质片，绝大多数情况下被作为医疗废物丢弃。这主要是因为植片尺寸过小很难满足常规角膜移植的供体需求。利用角膜屈光手术废弃的人角膜基质进行重构，制备一种满足常规角膜移植手术需求的供体植片是一种吸引人的方法。中国发明专利（申请号202010815050.0）公开了一种脱细胞人源角膜基质的制备方法。该发明将全飞秒激光屈光矫正手术的人角膜基质透镜进行脱细胞处理，得到具有良好的透明度的人角膜基质。但该发明未改变人角膜透镜的尺寸问题，过小的植片尺寸很难满足角膜移植的需求。

技术实现思路

1、为解决现有技术的不足，本发明一方面提供了一种人源生物角膜基质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a）制备人角膜基质溶液、b）制备聚乙二醇双丙烯酸酯（pegda）角膜基质骨架、c）将人角膜基质溶液浸入并固定到pegda角膜基质骨架中；

2、其中，步骤a）进一步包括如下步骤：

3、（a1）将人角膜基质浸泡在含有300-800u/ml脱氧核糖核酸酶的0.1-0.5% 脱氧胆酸钠溶液中1-5小时，随后用pbs缓冲液清洗，得到脱细胞人角膜基质；

4、本发明对人角膜基质的种类、状况和来源不作限制，包括天然人源组织溶液及其衍生物，例如人角膜溶液、脱细胞人角膜溶液、甲基丙烯酰化人源细胞外基质溶液。角膜基质可以是完整的、不完整的、破损的，来源于供体角膜、角膜屈光手术取下的人角膜基质透镜、角膜移植手术剩余的角膜环、人角膜脱细胞基质中的一种或多种混合材料。

5、脱细胞溶液的制备采用常规方法即可。

6、在一种优选的实施方式中，脱氧核糖核酸酶的浓度为500u/ml；脱氧胆酸钠溶液的浓度为0.2% 。

7、在一种优选的实施方式中，还可以加入1-2%曲拉通-100或0.5%-1%的十二烷基硫酸钠或0.1%-0.5%月桂酰基氨基酸；或加入1%-5%的右旋糖酐-400和1%-3%的硫酸软骨素，防止角膜组织在脱细胞过程中过度溶胀。

8、本发明中，在上述浸泡（浸入）过程中，可以同时采用超声、抽真空或搅拌的方式加速浸泡或浸入的过程。

9、在一种优选的实施方式中，浸泡步骤为将人源角膜浸入至少10倍体积量的脱细胞溶液的混合液中，置于恒温摇床，37℃，120转/分钟处理2-4小时。

10、（a2）将脱细胞人角膜基质冷冻干燥后称重，以1-10%的质量体积比，浸泡到胃蛋白酶溶液或胶原酶溶液中24-72小时；

11、所述胃蛋白酶溶液的浓度为1-5g/ml，优选为3g/ml。

12、在一种优选的实施方式中，所述胃蛋白酶溶液是用0.1n的盐酸溶液配置的。

13、所述胶原酶溶液，浓度为200-1000u/ml。

14、在一种优选的实施方式中，所述质量体积比为3-5%，更优选为3%。

15、本发明中，在上述浸泡（浸入）过程，优选在20-38℃条件下完成；可以同时采用超声、抽真空或搅拌的方式加速浸泡或浸入的过程。

16、在一种优选的实施方式中，所述浸泡过程还包括将溶液置于摇床120转/分钟，处理12-36小时，直至角膜组织完全消化；或将溶液置于加有磁性转子的烧杯中，置于磁力搅拌器上以200-500转每分钟，搅拌12-24小时，直至角膜组织完全消化。

17、（a3）加入碱性溶液中和，搅拌直至溶液的ph值为6.8-8.0，溶液恢复透明，得到人角膜基质溶液；

18、在一种优选的实施方式中，所述碱性溶液为1n的naoh，加入量为脱细胞人角膜基质溶液体积的1/10；搅拌直至溶液的ph值为7.0-7.6。

19、或（a3）将（a2）制备的人角膜基质溶液，置于冻干机中冻干，然后用磷酸盐缓冲液溶解，得到浓度为1%-10%的脱细胞人角膜基质溶液；

20、所述冻干的条件为：温度-50℃、真空度为500 mtorr的条件下冻干12-36小时。

21、步骤b）可通过两种方式制备，第一种是通过角膜模具制备，包括将pegda灌入角膜模具中，通过365nm紫外光源照射后得到pegda角膜基质骨架。第二种包括将pegda浸入到角膜基质中，并通过光激活或温度激活将其固化在角膜基质内部。随后通过10-25%的盐酸浸泡，去除角膜中的生物组分，保留pegda角膜基质骨架。

22、优选地，步骤b）包括如下步骤：

23、（b1）刮除新鲜角膜上皮和内皮，pbs缓冲液冲洗干净，得到角膜基质；

24、所述新鲜角膜选取具有与人角膜结构相同或近似的天然生物组织，包括但不限于来源于猪、马、牛等哺乳动物的眼角膜、脱细胞角膜、转基因角膜。

25、（b2）将角膜基质浸泡到30-100倍体积量的0.05-0.5g/ml pegda溶液中18-48小时；

26、所述pegda溶液含有光引发剂或温度引发剂。

27、在一种优选的实施方式中，所述的pegda溶液是利用0.1%-0.5%的lap溶液配置浓度为0.1g/ml-0.5g/ml的pegda溶液，优选pegda溶液浓度0.1g/ml。

28、在一种优选的实施方式中，所述光引发剂为蓝光或紫外光引发剂,包括2,4,6-三甲基苯甲酰基磷酸锂盐（lap）、光引发剂2959；所述温度引发剂包括偶氮二异丁腈（aibn）；光引发剂的为浓度0.1%-0.5%；温度引发剂的浓度为0.1-0.2 mol/l。

29、在上述浸泡（浸入）过程中，可以同时采用超声、抽真空、震荡的方式加速浸泡或浸入的过程；其中，超声频率为20-40hz，真空度为100 mtorr。

30、在一种优选的实施方式中，浸泡温度为室温， pegda溶液浓度为0.1-0.2g/ml；浸泡过程包括置于摇床，120转/分钟，震荡20-28小时。

31、（b3）取出角膜基质并通过光激活或温度激活，使pegda完全固化；

32、优选地，采用光激活时，激活条件为365nm，能量为100mw/cm2,激活的时间为30-120秒。

33、优选地，采用温度激活时，激活条件为 60-70℃，反应12-24小时。

34、在一种优选的实施方式中，所述激活的时间为60秒。

35、（b4）将固化后的角膜置于10-25%的盐酸溶液中24-48小时，随后用大量pbs缓冲液冲洗，直至ph值为6.8-8.0，得到pegda角膜基质骨架；

36、优选地，溶液的ph值为7.0-7.6。

37、步骤c）进一步包括如下步骤：

38、（c1）将步骤b）得到的pegda角膜基质骨架浸泡到步骤a）得到的人角膜基质溶液中，抽真空6-24小时；

39、（c2）取出pegda角膜基质骨架，去除表面溶液，静置20-60分钟；

40、（c3）将pegda角膜基质骨架浸泡于交联剂中至少10分钟，得到人源生物角膜基质；

41、在一种优选的实施方式中，步骤（c1）为将步骤b）得到的pegda角膜基质骨架浸泡到步骤a）得到的人角膜基质溶液中，抽真空18-24小时，随后置于120转/分钟摇床，4℃震荡18-48小时。

42、在上述浸泡（浸入）过程中，可以同时采用超声、抽真空或搅拌的方式加速浸泡或浸入的过程。

43、优选地，所述交联剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)、1-环己烷基-3-(2-吗啉代-乙基)-碳化二亚胺-n-甲基-p-苯-硫酸(cmc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、原花青素或京尼平中的一种或多种，交联剂的浓度为1%-5%。

44、在一种优选的实施方式中，所述交联剂为用50mm的吗啉乙磺酸溶液配置的5g/ml的cmc/nhs溶液。

45、本发明另一方面提供了通过上述方法制备的人源生物角膜基质及其作为角膜供体、角膜移植物、组织替代材料、组织密封剂或药物载体的应用。其具有与天然角膜基质相似的胶原纤维排列，良好的抗降解能力和机械性能，能够维持角膜基质细胞表型的特性，在380nm-780nm波长内的透光率为60-80%，与天然角膜透光率相似。

46、有益效果

47、本发明提供一种人源生物角膜基质的制备方法。该方法的原理是将角膜屈光手术中制备的角膜基质片重构，重新组装到pegda角膜骨架中，制备具有生物粘合能力可满足角膜移植需求的人源角膜基质材料，从而解决当前供体角膜严重短缺、费用昂贵的问题。