一种负载富血小板血浆的缓释水凝胶及其制备方法与应用

本发明属于生物医学材料，具体涉及一种负载富血小板血浆的缓释水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术：

1、目前子宫内膜损伤的衍生疾病已成为一种常见病，我国适龄生育女性的不孕率超过18％，其中子宫内膜损伤的患者占比20％，iua患者总计超过1500万名。且子宫内膜损伤患者人数增长迅速，每年因人流手术新增iua患者超过500万名。在子宫内膜损伤严重影响女性生理功能及生育健康的情况下，手术为首选治疗方式，但术后复发率高(重度iua可达62.5％)、妊娠率低(重度iua仅为44.3％)，手术后的辅助措施治疗效果不佳且副作用风险较高，是当下治疗子宫内膜损伤恢复患者生育能力市场的痛点。

2、临床常用的术后修复方法包括药物、生物材料、细胞治疗、物理治疗、物理屏障等，多为综合性治疗。雌激素等药物，帮助宫腔粘连术后促进子宫内膜生长、改善子宫血流，但大剂量雌激素的应用使得乳腺癌、卵巢癌等雌激素相关性肿瘤发病风险升高。生物屏障或材料主要包括羊膜制品和透明质酸及其衍生物，另外还包括粒细胞集落刺激因子。研究表明，tcra术后宫腔应用羊膜可以增加患者术后月经量，减少术后再粘连形成，但均未明显改善妊娠结局。

3、细胞治疗多使用干细胞为原料进行子宫内膜修复。在大量动物实验中，各类间充质干细胞(mesenchymal stem cell,msc)均可不同程度地促进子宫内膜损伤修复和改善生殖预后。但目前应用仅停留在动物实验或体外实验阶段，尚无临床应用的报道，其应用于临床治疗iua仍需更多的深入研究和探索。物理治疗尤其是低频神经肌肉电刺激(neuromuscular electrical stimulation,nmes)应用于iua以促进子宫内膜的修复。nmes又称经皮穴位电刺激，是一种源自针灸疗法的技术，它可通过刺激盆腔肌肉神经，促进子宫内膜和子宫肌层的血液循环，刺激子宫内膜的生长，增加子宫内膜的厚度，改善子宫内膜容受性。物理治疗仍需要大样本随机对照研究来验证其效果及安全性，盆底电生理治疗促进子宫内膜修复的作用机制、最佳参数及使用频率也需进一步探讨；物理屏障治疗数据显示，各种物理屏障对患者后续妊娠率的提高并无明显差异。

4、透明质酸可以减少宫腔操作术后子宫内膜的损伤，提高宫腔镜术后的妊娠率，其也是子宫粘连tcra术后的二级预防措施。透明质酸具有流动性，在宫腔内注射后可以充分隔离创面，缺点是半衰期较短，易流出宫腔影响治疗效果。因此，临床多用透明质酸凝胶来降低其流动性，延长在宫腔内停留时间，特别是自交联透明质酸钠凝胶，其在宫腔内停留时间更长，可以更好地预防粘连的复发。透明质酸钠凝胶能够在子宫腔创面间形成机械屏障，促进上皮细胞与间质细胞再生，从而促进子宫内壁血管收缩与新血管生成，有效防止出血，渗血；且透明质酸钠分子能够缓解局部炎症反应，降低感染几率，同时有效抑制纤维蛋白沉积，减少粘连骨架的形成，有效降低并发症发生率。

5、研究表明，透明质酸凝胶可以降低iua的复发率，在辅助生殖技术领域，中重度iua患者术后应用自交联透明质酸钠凝胶可以改善子宫内膜质量和子宫容受性，从而提高体外受精/卵胞浆内单精子注射(ivf/icsi)和冻融胚胎移植(fet)后的临床妊娠率，但交联剂的使用会导致残留、毒性难降解、效果不均匀、活性不可调节等问题，因此，发明一种不使用交联剂的透明质酸钠凝胶材料来治疗子宫内膜的损伤是具有积极意义的。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，克服传统交联剂使用带来的消极影响，本发明提供了一种负载富血小板血浆的缓释水凝胶及其制备方法与应用，其目的是不使用交联剂的同时实现了交联效果，实现交联剂零残留，具有无毒性、无残留、降解缓慢、作用时间长、效果均匀、活性可调节的特点，在透明质酸水凝胶中融合入富血小板血浆(prp)和钙离子激活的凝血酶，利用了金属离子配位技术等创新点，可有效治疗部分或全部闭塞的宫腔粘连，从而改善因子宫粘连而导致的月经量减少、闭经、复发性流产和不孕等症状。

2、为达到上述目的，本发明首先提供了一种负载富血小板血浆的缓释水凝胶，包括修饰有双膦酸根的透明质酸、富血小板血浆、ca2+激活的凝血酶和无ca2+缓冲液，所述凝血酶通过ca2+与修饰有双膦酸根的透明质酸金属配位结合，同时凝血酶催化富血小板血浆中的纤维蛋白原形成稳定的双网络结构。

3、作为优选，所述修饰有双膦酸根的透明质酸的终浓度为10mg/ml；所述富血小板血浆和ca2+激活的凝血酶的体积比为9:1。

4、基于一个总的发明构思，本发明还提供了负载富血小板血浆的缓释水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

5、s1、制备含有巯基修饰的透明质酸：将透明质酸钠粉末与去离子水中、3,3'-二硫代二(丙酸肼)进行混合，然后将1-羟基苯并三唑与乙腈和水的混合液加热混合，再加入上述的混合溶液中，先加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，立即调节ph为4.5～5，避光反应后调节溶液ph为8～8.5，加入二硫苏糖醇，再次反应后透析、冷冻干燥、得到巯基修饰的透明质酸固体；

6、s2、制备修饰有双键的双膦酸盐：将氨基双膦酸盐与naoh溶液混合，放置于冰浴条件进行反应，将丙烯酰氯分四次加入，然后常温反应，使用乙酸乙酯进行萃取，旋转蒸发浓缩，甲醇沉淀，得到修饰有双键的双膦酸盐；

7、s3、制备修饰有双膦酸根的透明质酸：将去离子水中通入足量的氮气，取步骤s1得到的巯基修饰的透明质酸，溶解在除氧水中，再加入步骤s2得到的修饰有双键的双膦酸盐，溶解后加入2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，溶解后紫外照射进行反应，透析，冷冻干燥，得到修饰有双膦酸根的透明质酸；

8、s4、制备负载富血小板血浆的缓释水凝胶材料：将步骤s3得到的修饰有双膦酸根的透明质酸溶解于富血小板血浆中，然后调节ph至7，加入无ca2+缓冲液，最后加入ca2+激活的凝血酶溶液得到负载富血小板血浆的缓释水凝胶(ha-bp@prp)。

9、作为优选，所述s1步骤中透明质酸钠粉末、3,3'-二硫代二(丙酸肼)、1-羟基苯并三唑、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、二硫苏糖醇、1-羟基苯并三唑的质量比为23-25∶1∶8-9∶3-4∶3-4；所述避光反应时间为10h，再次反应时间为8h。

10、作为优选，所述s2步骤中naoh溶液的质量浓度为2％；所述氨基双膦酸盐、naoh溶液、丙烯酰氯的质量比为1-2∶1∶1-2，所述冰浴温度为0℃～1℃，冰浴反应的时间为1h；所述常温反应时间为1.5h。

11、作为优选，所述s3步骤中巯基修饰的透明质酸、修饰有双键的双膦酸盐、2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的质量比为7-8∶3-4∶1；所述反应的时间为10min～15min。

12、作为优选，所述s4步骤中无ca2+缓冲液为pbs缓冲液。

13、基于一个总的发明构思，本发明还提供了负载富血小板血浆的缓释水凝胶在作为子宫内膜损伤修复药物载体中的应用。

14、作为优选，所述负载富血小板血浆的缓释水凝胶可注射。

15、本发明负载富血小板血浆的缓释水凝胶治疗子宫内膜损伤的机理如下：

16、prp可释放具有天然配比的生物自活性因子，各种生长因子浓度比例接近体内正常比例，通过相互作用促进伤口愈合和细胞再生。此外，prp含有大量细胞生长因子，如表皮生长因子(egf)、血小板源性生长因子(pdgf)、转化生长因子—β(tgf-β)等。其中表皮生长因子(egf)可刺激子宫内膜腺上皮和间质的增生，并在孕激素的协同作用下使间质发生分化；血小板生长因子可以促进间质细胞本身或其邻近上皮细胞的增生；转化生长因子能使正常的成纤维细胞的表型发生转化。这些生长因子相互协同作用，提高旁分泌水平，使细胞耐受不良环境的能力更强，缓解细胞的凋亡，促进细胞增生。

17、本发明水凝胶材料包括修饰有双膦酸根的透明质酸、prp和钙离子活化的凝血酶，凝血酶中添加的金属钙离子与透明质酸上的双膦酸根的p-o基团通过金属配位结合，同时被钙离子激活的凝血酶又可以催化prp中的纤维蛋白原形成纤维蛋白网络，这是更为稳定的双网络结构。本发明的负载富血小板血浆的水凝胶材料自身降解较为缓慢，搭载的富血小板血浆缓释作用时间长，因此，该水凝胶材料可在患处长时间作用。

18、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

19、(1)本发明在透明质酸水凝胶中融合入prp和凝血酶钙离子，利用了金属离子配位技术等创新点，凝血酶中添加的金属钙离子与透明质酸上的双膦酸根的p-o基团通过金属配位结合，同时被钙离子激活的凝血酶又可以催化prp中的纤维蛋白原形成纤维蛋白网络，这是更为稳定的双网络结构，这种稳定的结构决定了负载富血小板血浆的缓释水凝胶的降解缓慢，搭载的富血小板血浆缓释作用时间长等特性，可在患处长时间作用。

20、(2)本发明区别于传统治疗方法，不使用小分子交联剂的同时实现了交联效果，实现交联剂零残留、降解缓慢、作用时间长、效果均匀、活性可调节的特点。

21、(3)本发明的负载富血小板血浆的缓释水凝胶具有可注射性具有重要意义，可以将负载有治疗子宫内膜损伤药物的水凝胶原位注射到损伤部位周围从而达到局部缓释的作用。这种药物输送方式，不用经过全身血液系统，在一定程度上规避了发生免疫抑制的风险，且包封率优异，具有更长的作用时间，具有良好的生物相容性，对细胞无毒。