一种巨噬细胞靶向二氧化锰纳米系统的制备方法及其应用

本发明涉及生物医学，更具体的说是涉及一种巨噬细胞靶向二氧化锰纳米系统的制备方法及其应用。

背景技术：

1、近年来，功能纳米材料已被大量研究，将纳米技术和材料科学结合应用于医学生物学和疾病治疗使纳米药物越来越多地用于临床疾病的诊疗。纳米材料在传染病的预防和治疗方面也显示出巨大的潜力。如果能结合功能纳米材料的宿主细胞免疫调控功能和宿主细胞靶向药物递送功能，有望实现针对结核病等以巨噬细胞为宿主细胞传染病的更有效治疗，然而，目前仍无能有效结合宿主细胞免疫调控功能和宿主细胞靶向药物递送功能的抗结核系统。

2、锰(mn)是一种无机微量元素，在动物机体的多种生理过程中具有重要的氧化调节作用和其他方面的活性。研究表明，宿主细胞抗肿瘤和抗病毒反应通路严重依赖于锰离子(mn2+)，锰离子可以刺激cgas/sting途径激活先天免疫和适应性免疫。然而，mn2+非常不稳定，其生物医学应用受到严重限制。二氧化锰纳米颗粒(mno2 nps)是一种稳定且生物相容性良好的纳米粒子，可在不同配体修饰后作为靶向递送的药物载体进行药物递送，并且还能与细胞内谷胱甘肽(gsh)反应生成mn2+，从而通过mn2+的生物学功能激活cgas/sting通路以调控机体免疫。mno2 nps在抗肿瘤和抗病毒治疗中显示出强大的潜力。综上所述，mno2nps是理想的药物递送载体及cgas/sting途径激动剂。与其他金属化合物纳米粒子相比，mno2 nps相对来说安全性更高，易于代谢，便于修饰，且能作为优良的cgas/sting激活剂。

3、结核病是由结核分枝杆菌(mtb)感染引起的慢性传染病，世界上约四分之一的人口均为mtb潜伏感染者，是全球传染范围最广且最致命的传染病之一。基于“高传染性”、“高致病性”的特点，全世界的结核发病率和死亡率居高不下。

4、肺泡巨噬细胞可以吞噬不同的宿主细胞杀菌免疫病原体，并通过抗原向t细胞递呈启动保护性适应性免疫反应，是抵抗结核分枝杆菌感染和停留的第一道免疫防线。但结核分枝杆菌已经发展出大量复杂的免疫逃逸策略—通过抑制巨噬细胞的一些关键抗结核免疫反应，如抑制mtb与溶酶体融合、抑制巨噬细胞自噬、抑制巨噬细胞凋亡和抑制巨噬细胞m1抗菌极化，以及抑制抗原呈递和t细胞的抗结核细胞因子产生以逃避宿主细胞的抗菌机制。因此，探索抑制结核菌免疫逃逸并促进抗结核免疫的新策略有助于开发更有效的抗结核策略。

5、巨噬细胞的m1抗菌极化是其主要的抗结核功能之一，m1型巨噬细胞可通过分泌大量促炎因子(如tnf-α和il-6等)以抑制胞内mtb的生长，并激活t细胞分泌ifn-γ等杀伤性细胞因子，从而增强机体的抗结核免疫应答以更有效抑制胞内mtb，另一方面，在结核菌感染过程中，被吞噬的结核菌可将dna等信号分子释放到巨噬细胞的细胞质中，巨噬细胞的cgas能感知dna并被激活。而活化的cgas则催化三磷酸腺苷酸和三磷酸鸟苷生成cgamp，最终激活sting。这种激活的sting进一步结合并激活磷酸化干扰素调节因子irf3的tbk1，提高ifn-β以及tnf-α的产生，激活细胞内自噬，从而更有效清除和控制mtb感染。

6、因此，提供一种巨噬细胞靶向二氧化锰纳米系统的制备方法及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种巨噬细胞靶向二氧化锰纳米系统的制备方法及其应用。本发明制备了巨噬细胞靶向装载利福平、表面修饰有tuftsin(tuf)多肽的二氧化锰的纳米系统(tuf-rif@ha-mno2nps)，从而获得有望结合宿主细胞免疫调控功能和宿主细胞靶向药物递送功能的新型纳米载药系统。本发明有望将其用于结核病的宿主靶向治疗及疫苗开发，并对其他疾病预防和治疗提供新思路。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、(1)mno2 nps的制备

4、用水将37.4mg/ml pah溶液稀释10倍后，加入40％体积分数的3.5mg/ml高锰酸钾(kmno4)溶液，混合均匀后于室温下避光反应至所有高猛酸盐均转化为二氧化锰；得到的溶液离心，弃去沉淀，将得到的上清液透析过夜，收集透析袋内的溶液即为二氧化锰纳米颗粒(mno2nps)。

5、(2)rif@ha-mno2 nps的制备

6、在mno2 nps溶液中加入20％体积分数的5mg/ml利福平溶液、4％体积分数的1mg/ml透明质酸(hyaluronic acid，ha)溶液、1％体积分数的1mg/ml edc溶液、1％体积分数的1mg/mlnhs溶液，混合均匀后避光于4℃冰箱摇床反应过夜，反应后进行透析并收集透析袋内溶液即可得到rif@ha-mno2nps。

7、(3)tuf-rif@ha-mno2 nps的制备

8、配置1mg/ml tuftsin多肽溶液，配置好后向其中加入5％体积分数的1mg/ml edc溶液、5％体积分数的1mg/mlnhs溶液，混匀后于4℃静置10min，10min后向其中加入与tuftsin多肽溶液等体积的上述制备好的rif@ha-mno2 nps溶液，混匀后于4℃静置反应过夜，过夜后进行透析并收集透析袋内溶液，即可得到tuf-rif@ha-mno2 nps。

9、进一步，利用上述方法制备得到的装载利福平、表面修饰有tuftsin多肽的二氧化锰纳米系统tuf-rif@ha-mno2 nps。

10、进一步，所述的tuf-rif@ha-mno2 nps在靶向巨噬细胞中的应用。

11、进一步，所述的tuf-rif@ha-mno2nps在制备抑制结核分支杆菌药物中的应用。

12、进一步，所述的tuf-rif@ha-mno2 nps在制备治疗结核病药物中的应用。

13、进一步，所述的tuf-rif@ha-mno2 nps在制备结核病疫苗中的应用。

14、本发明具体为将二氧化锰纳米粒(mno2 nps)作为药物载体的制备方法以及其在结核菌宿主靶向治疗和疫苗开发中的潜在应用。mno2 nps具有制备方法简单、生物相容性高、易功能化等优点，作为载体表现出靶向递送的巨大潜力。利用mno2 nps的这些特性，对其进行药物装载后，进一步修饰巨噬细胞靶向多肽，从而构建巨噬细胞靶向的二氧化锰抗结核纳米系统。本发明将宿主细胞靶向药物治疗及免疫调控疗法联用，有望用于结核菌宿主靶向治疗以及结核病疫苗的开发，为结核病等以巨噬细胞为宿主细胞的传染病提供新的预防和治疗策略。

15、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种巨噬细胞靶向二氧化锰纳米系统的制备方法及其应用，具有以下有益效果：

16、(1)mno2 nps能高效地装载药物，并通过巨噬细胞靶向多肽的偶联使其具有巨噬细胞靶向性；

17、(2)tuf-rif@ha-mno2 nps具有良好的生物相容性；

18、(3)tuf-rif@ha-mno2 nps能有效杀伤和抑制胞内结核分枝杆菌。