经酸酐修饰的蛋白质抑制痘病毒的方法与流程

本发明涉及生物医药领域，特别涉及酸酐修饰的蛋白质预防和控制痘病毒的方法。

背景技术：

1、痘病毒是一类结构较为复杂的dna病毒，其基因组是线性双链的dsdna，具有高传染性和感染性，感染后会出现发热、出疹、咳嗽等症状。痘病毒科的多个种属都可以感染人类，历史上痘病毒对人类的危害包括导致天花、水痘、猴痘等传染病，其中天花已经被全球消灭，而猴痘仍在非洲和美洲流行，并在2022年出现世界范围内的疫情大爆发。此外，痘病毒还会感染动物，如牛、羊、猪等家畜，其中羊痘和猪痘等动物疾病也是严重的流行病。因此，对痘病毒监测与防控对于维护人类公共卫生安全至关重要。

2、在2022年，大约70个国家和地区先后报告了猴痘病例的出现，其中部分包括欧洲国家和美国，而此前持续性猴痘传播主要发生在非洲。这种跨域传播的新情况引起了世界卫生组织(who)的高度重视，紧急宣布2022年猴痘的爆发是国际关注的突发公共卫生事件(pheic)，时隔数年的痘病毒大流行再次引发人们的关注。调查研究表明，猴痘会引起类似于天花的症状，但表现通常比天花更温和——其前期症状表现为身体多处乏力、发热、肿痛，而淋巴结肿大是猴痘而非天花的典型表现；前期过后，即出现典型皮疹，并会迅速从面部蔓延至全身；同时，猴痘会使人更容易患上其他感染，某些患有猴痘的人会在皮肤和肺部发生细菌感染。尽管症状较为温和，但据研究表明，猴痘的死亡率仍接近10％。推测可能由于猴痘病例的聚集性与猴痘病毒的传播方式都相对独立，监测难度较大，由此带来的病毒突变与进化也无法准确预知。虽然猴痘自1958年发现至今已流行将近70年，但由于疏于防控，仍不可避免地造成了当下的大流行。

3、研究结果表明，2022年至今引发猴痘大流行的猴痘病毒，相较于之前的毒株已发生了不同程度的核苷酸突变及基因缺失，本次疫情的流行株属于猴痘病毒新毒株，其进化速度快于正常的进化速度，意味着持续突变的可能性。因此，亟需积极有效的针对性预防与治疗措施。目前有两种获得许可的曾用于预防天花的疫苗可用于预防猴痘：acam2000和jynneos，acam2000是一种活牛痘病毒，可以在体内复制，容易引起严重的副作用；jynneos是一种减毒的非复制型牛痘疫苗，安全系数相对较高。相较于预防措施，猴痘的治疗措施却十分有限，抗病毒药物替韦立马、西多福韦或布林西多福韦可能有利于缓解猴痘症状，但尚未作为猴痘的针对性治疗药物用于临床。

4、从历史上的防控手段中可以得知，针对目前流行的猴痘病毒与未来可能引发大流行的其他痘病毒，均以预防为主，暂无针对痘病毒的特效药物。因此，亟需研发一种安全、有效的针对痘病毒的治疗性药物，这对于控制未来可能再次出现的痘病毒大流行具有深远意义。

技术实现思路

1、2022年至今引发猴痘大流行的猴痘病毒，相较于之前的毒株已发生了不同程度的核苷酸突变及基因缺失，本次疫情的流行株属于猴痘病毒新毒株，其进化速度快于正常的进化速度，意味着持续突变的可能性。目前对于这种猴痘病毒新毒株的研究还处于起步阶段。本发明部分基于发明人的如下发现，经酸酐修饰的蛋白质可以有效抑制猴痘病毒新毒株和痘病毒。

2、在本发明之前，发明人和其他科技工作者发现经酸酐修饰的蛋白质具有较好的抗hpv、hiv、hsv以及冠状病毒等病毒的活性，具备开发成为抗病毒药物的巨大潜力。

3、cn105031623a公开了生物制剂及在制备预防和控制埃博拉病毒的药物中的应用。该专利公开了一系列生物制剂对埃博拉病毒的治疗效果，表明酸酐修饰的hsa、ova、bsa、mas、β-lg对zaire型和sudan型假病毒具有抑制效果，其中hsa衍生物具有最佳的抑制效果，表明了不同类型的酸酐修饰的蛋白质对不同埃博拉病毒毒株具有差异的抑制效果。

4、cn112316152b公开了经酸酐修饰的蛋白质抑制冠状病毒的方法。该专利表明经酸酐修饰的蛋白质抑制新型冠状病毒，但是也证明了对中东呼吸综合征的mers-cov活性很弱，且不同修饰策略和不同蛋白的酸酐修饰都具有较大效果差异。

5、chen hua等人(chen hua等人，front microbiol.2019；10:2188)先前证明了3-羟基邻苯二甲酸酐(3hp)修饰的牛β-乳球蛋白(3hp-β-lg)在抑制高风险和低风险人hpv的假病毒进入靶细胞方面非常有效。阴道内应用含3hp-β-lg的阴道凝胶可显著抑制hpv感染，降低宫颈区域的病毒载量。发现3hp-β-lg与hpv l1蛋白中的带正电区域结合，表明3hp-β-lg通过1hp-β-lg中带负电荷的区域与hpv l3蛋白中的带正电区域之间的相互作用与hpvl1蛋白结合，从而竞争性地阻断hpv与阴道粘膜基底膜受体的结合。该文献证明了3hp修饰的鸡卵清蛋白(3hp-ova)也带有高净负电荷，但没有表现出抗hpv活性。该文献指出3hp修饰的蛋白与hpv l1蛋白之间的相互作用依赖于两种蛋白质中结合位点的静电和可匹配构象。

6、先前还证明了3-羟基邻苯二甲酸酐修饰的牛β-乳球蛋白(3hp-β-lg)有效抑制不同甲型和乙型流感病毒感染，认为3hp-β-lg可能通过其带负电荷的残基与流感病毒ha的血凝素1(ha1)亚基中的受体结合结构域结合，从而抑制ha与宿主细胞上唾液酸的附着(yuhong fu等人，viruses.2022sep；14(9):2055)。鼻内给药3hp-β-lg可保护小鼠免受甲型h1n1流感/pr8、甲型h3n2和甲型h7n9流感病毒的攻击。牛乳铁蛋白(blf)已被证明可以通过其c叶与病毒ha中含有高度保守区域的融合肽相互作用来抑制流感病毒h1n1和h3n2的感染，从而阻断病毒与宿主细胞的融合并防止流感病毒诱导的致病作用。通过亲核取代化学反应对3hp进行β-lg修饰，能够使β-lg中带正电荷的碱性氨基酸成为3hp-β-lg中带负电荷的酸性氨基酸，导致净负电荷显著增加，可以增强3hp-β-lg与病毒ha的结合亲和力。发明人认为流感病毒的ha中可以与3hp-β-lg相互作用的区域对于3hp-β-lg的作用机制至关重要。

7、先前还证明了3hp-β-lg可以预防和治疗sars-cov-2感染(chen hua等人，signaltransduction and targeted therapy volume 6,article number:318(2021))。发明人认为3hp-β-lg和sars-cov-2刺突蛋白rbd之间的结合竞争性地阻断了rbd和细胞上ace2受体之间的相互作用，来实现预防和治疗的效果。

8、发明人先前发现3hp-β-lg在甲流病毒和乙流病毒，以及不同甲流病毒株之间的效果差异(见cn109675042a)。

9、猴痘病毒与先前验证的hpv、hiv、hsv以及冠状病毒没有共同的表面蛋白，如hpvl1蛋白、刺突蛋白rbd或血凝素1(ha1)亚基等。

10、发明人先前还发现不同修饰策略和不同蛋白的酸酐修饰对不同病毒种或病毒株都具有较大效果差异。特别地，发明人先前发现酸酐修饰的蛋白对中东呼吸综合征的mers-cov活性很弱。尚未报道酸酐修饰的蛋白是否可阻断病毒进入细胞。因此，发明人在本发明前预测酸酐修饰的蛋白对猴痘病毒可能不具备抑制活性，或者至少不能与先前验证的病毒一样有效地抑制猴痘病毒。基于此，在猴痘疫情大规模爆发后，发明人便开展了酸酐修饰的蛋白质对猴痘病毒抑制活性的相关研究。与发明人的最初设想不同，发明人在实验过程中发现经酸酐修饰的蛋白质(3hp-β-lg)具有优良的抗猴痘病毒与痘苗病毒天坛株的活性并将相关结果在本发明中进行展示。

11、由于本次猴痘的流行株属于猴痘病毒的新毒株，研究学者对其诸多特征仍然未知，特效药物的研发速度也相对较缓，且目前尚未出现酸酐修饰的蛋白质在痘病毒层面的应用，因此本发明的相关研究具有前瞻性与创新性。基于发明人团队丰富的药物研发经验，本发明首次鉴定了经酸酐修饰的蛋白质对猴痘病毒新毒株及痘苗病毒天坛株具有优良的抗病毒活性，相关修饰策略及抗病毒活性结果也为相关药物开发提供了科学依据。

12、本发明的目的是针对痘病毒特异性药物的缺乏和不足状况，提供一种新型的预防和控制痘病毒感染的生物药物制剂。本发明的研究结果表明，经酸酐修饰的蛋白质(3hp-β-lg)具有优良的抗猴痘病毒与痘苗病毒天坛株的活性，为后续药物开发奠定了夯实的研究基础。

13、具体而言，本发明通过以下实施方案解决了领域内预防和控制痘病毒感染的关键科学问题：

14、在一方面，提供了经酸酐修饰的蛋白质或包含经酸酐修饰的蛋白质的组合物在体外抑制痘病毒生长、预防或控制痘病毒感染的方法，所述方法包括使所述经酸酐修饰的蛋白质或包含经酸酐修饰的蛋白质的组合物与含有、疑似含有或有风险含有痘病毒的物品或样品接触的步骤；

15、其中所述蛋白质选自β乳球蛋白、白蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白和rna酶，所述酸酐选自3-羟基邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐或马来酸酐。

16、在一个实施方案中，根据所述蛋白质的赖氨酸和精氨酸修饰比率测定，所述蛋白质是完全酸酐化的。

17、在一个实施方案中，样品选自痘病毒感染者呼吸道分泌物、病变渗出物、血液、尿液、粪便、体液或培养液。

18、在一个实施方案中，物品选自痘病毒感染者个人物品、痘病毒感染者接触过的公共物品、痘病毒感染者所用润滑剂与避孕套。

19、在一个实施方案中，痘病毒是任一痘病毒。

20、在一个实施方案中，痘病毒属于正痘病毒属。

21、在一个实施方案中，痘病毒是猴痘病毒和/或痘苗病毒。优选地，猴痘病毒是分支i和/或分支ii的猴痘病毒株，优选是mpxv-b.1猴痘病毒株。

22、在一个实施方案中，β乳球蛋白是牛β乳球蛋白。在一个实施方案中，白蛋白选自血清白蛋白或卵清蛋白，优选人血清白蛋白、牛血清白蛋白或鸡卵清蛋白。在一个实施方案中，纤维蛋白原是牛纤维蛋白原。在一个实施方案中，胶原蛋白选自胶原蛋白ⅰ-iii型。在一个实施方案中，rna酶选自rna酶1或rna酶7。

23、在一个实施方案中，组合物为溶液、酊剂、醑剂、粉末剂、洗剂、油剂、乳剂、软膏、糊剂、硬膏、涂膜剂、凝胶或气雾剂的形式。

24、在一个实施方案中，经酸酐修饰的蛋白质通过使所述酸酐与所述蛋白质混合制备。

25、在另一方面，提供了经酸酐修饰的蛋白质或包含经酸酐修饰的蛋白质的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防受试者中的痘病毒感染或由痘病毒感染引起的疾病。还提供了治疗或预防受试者中的痘病毒感染或由痘病毒感染引起的疾病的方法，其包括施用酸酐修饰的蛋白质或包含经酸酐修饰的蛋白质的组合物。在一个实施方案中，该用途或方法通过阻断或封闭包括a29l的表面蛋白实现。组合物还可以包含抗痘病毒(例如猴痘病毒)药物，例如替韦立马、西多福韦或布林西多福韦。

26、在一个实施方案中蛋白质选自β乳球蛋白、白蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白和rna酶，所述酸酐选自3-羟基邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐或马来酸酐。

27、在一个实施方案中根据所述蛋白质的赖氨酸和精氨酸修饰比率测定，所述蛋白质是完全酸酐化的。

28、在一个实施方案中，痘病毒是任一痘病毒。

29、在一个实施方案中，痘病毒属于正痘病毒属。

30、在一个实施方案中，痘病毒是猴痘病毒和/或痘苗病毒。优选地，猴痘病毒是分支i和/或分支ii的猴痘病毒株，优选是mpxv-b.1猴痘病毒株。

31、在一个实施方案中，β乳球蛋白是牛β乳球蛋白。在一个实施方案中，白蛋白选自血清白蛋白或卵清蛋白，优选人血清白蛋白、牛血清白蛋白或鸡卵清蛋白。在一个实施方案中，纤维蛋白原是牛纤维蛋白原。在一个实施方案中，胶原蛋白选自胶原蛋白ⅰ-iii型。在一个实施方案中，rna酶选自rna酶1或rna酶7。

32、在一个实施方案中，药物是片剂、胶囊、粉剂、滴鼻剂或气雾剂的形式，或者溶液、酊剂、醑剂、粉末剂、洗剂、油剂、乳剂、软膏、糊剂、硬膏、涂膜剂、凝胶或气雾剂的形式。

33、在一个实施方案中，经酸酐修饰的蛋白质通过使所述酸酐与所述蛋白质混合制备。

34、在又一个方面，提供了封闭痘病毒的表面蛋白的方法，所述方法包括使所述经酸酐修饰的蛋白质或包含经酸酐修饰的蛋白质的组合物与痘病毒接触的步骤，所述表面蛋白包括a29l或a27蛋白。a29l可以包含seq id no:1所示的氨基酸序列或者与seq id no:1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

35、在一个实施方案中，蛋白质选自β乳球蛋白、白蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白和rna酶，所述酸酐选自3-羟基邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐或马来酸酐。在一个实施方案中，根据所述蛋白质的赖氨酸和精氨酸修饰比率测定，所述蛋白质是完全酸酐化的。在一个实施方案中，痘病毒属于正痘病毒属。在一个实施方案中，痘病毒是猴痘病毒和/或痘苗病毒。在一个实施方案中，猴痘病毒是分支i和/或分支ii的猴痘病毒株，优选是mpxv-b.1猴痘病毒株。

36、在又一个方面，提供了经酸酐修饰的蛋白质作为痘病毒a29l、a27蛋白或其同源物的结合剂的用途，其中所述蛋白质选自β乳球蛋白、白蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白和rna酶，所述酸酐选自3-羟基邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐或马来酸酐。在一个实施方案中，根据所述蛋白质的赖氨酸和精氨酸修饰比率测定，所述蛋白质是完全酸酐化的。在一个实施方案中，痘病毒属于正痘病毒属。在一个实施方案中，痘病毒是猴痘病毒和/或痘苗病毒。在一个实施方案中，猴痘病毒是分支i和/或分支ii的猴痘病毒株，优选是mpxv-b.1猴痘病毒株。相对于痘病毒的其他膜蛋白，经酸酐修饰的蛋白质可以选择性结合痘病毒a29l、a27蛋白或其同源物。结合剂可以为选择性结合剂。

37、本发明的优点包括：

38、1.发明人首次发现了酸酐修饰的蛋白质可用于预防猴痘病毒和/或痘苗病毒感染和/或治疗猴痘病毒和/或痘苗病毒感染或其相关的疾病。

39、2.发明人首次发现了酸酐修饰的蛋白质可以阻断或封闭猴痘病毒和/或痘苗病毒的表面蛋白a29l或a27蛋白。

40、3.发明人发现酸酐修饰的蛋白质可以以高效(ic50低于100μg/ml)抑制猴痘病毒和/或痘苗病毒，优于一些先前已经验证的病毒株的抑制效果(例如cn109675042a中的乙型流感，如b/florida/2006；cn 111053892 a中的肠道病毒，如cv-a16病毒)。

41、4.与无明显抑制效果的su-β-lg和ml-β-lg相比，3hp-β-lg和3hp-fg可以高效(ic50低于100μg/ml)抑制猴痘病毒和/或痘苗病毒。