一种葡萄糖MMP-9基质酶双响应层层释药糖尿病创面愈合凝胶及其制备方法和应用与流程

本发明属于医药用品领域，涉及一种葡萄糖mmp-9基质酶响应层层释药糖尿病创面愈合凝胶及其制备方法和应用，尤其涉及能够针对糖尿病创面特殊环境响应、依据创面发展阶段特异性缓释功效药物凝胶载体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、糖慢性糖尿病伤口是糖尿病的一种严重并发症，常常导致高昂的治疗费用和高截肢率。由于生理上的差异急性和慢性伤口的环境，造成慢性糖尿病创面难以愈合。正常伤口的愈合包括止血、炎症、增殖和重建，然而，针对糖尿病创面，高浓度的葡萄糖和基质金属蛋白酶伤口微环境中的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，mmps)阻碍了慢性糖尿病伤口进入组织重塑阶段。异常炎症引起促炎因子的分泌上调，进一步扰乱体内平衡mmps和金属蛋白酶的组织抑制剂(timps)，并导致伤口中mmps的过度分泌，特别是mmp-9(基质金属蛋白酶9)在糖尿病溃疡中的表达量是创伤性溃疡的14倍。其中mmp-9被认为是治疗慢性糖尿病创面的新靶点。

2、由于水凝胶能够吸收伤口渗出物，保持伤口部位的水分，并且具有与软组织相匹配的合适模量，因此受到了广泛的关注。在过去的几年里，具有多种功能的水凝胶，如具有活性氧清除、抗菌、调节免疫细胞和促进血管生成功能的水凝胶被设计用来调节伤口的微环境。智能可响应性水凝胶可以依据糖尿病创面的特殊环境，针对创面不同发展阶段，特异性缓控释放功效性药物。

技术实现思路

1、针对糖尿病创面的特殊性，本发明的目的在于，针对糖尿病特殊创面环境和创面愈合不同发展阶段，设计出葡萄糖和mmp-9酶响应双层凝胶敷料，短期缓释抗炎药物抑制炎症发生，长期缓释修复性多肽修复创面，二者组合能够起到层层缓释特异性功效药物的效果，达到全方面治愈糖尿病创面的疗效。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供葡萄糖mmp-9基质酶双响应层层释药凝胶是由4-arm-peg-sg(四臂-聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊二酸酯)、3-氨基苯硼酸、不同分子量质量浓度pva发生酰胺化和硼酯键反应生成的。本发明创造性地葡萄糖和mmp-9基质酶双响应层层释药水凝胶，针对糖尿病创面环境高葡萄糖浓度和mmp-9酶高表达的特性，选用具有葡萄糖敏感的硼酯键作为交联键。

3、第一方面，本发明提供了一种创面愈合用水凝胶，所述水凝胶是由4-arm-peg-sg(四臂-聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊二酸酯)同3-氨基苯硼酸酰胺化反应后，再与pva(聚乙烯醇)生成硼酯键得到的。

4、在本发明的一种实施方式中，所述的4-arm-peg-nhs、3-氨基苯硼酸及pva摩尔比为3：4000：13或3：4000：6。

5、在本发明的一种实施方式中，所述4-arm-peg-nhs的分子量为100000至200000。

6、在本发明的一种实施方式中，所述pva的分子量为30000～200000。

7、在本发明的一种实施方式中，所述水凝胶具体通过以下方法制备得到：先将4-arm-peg-sg和3-氨基苯硼酸溶解于水中，并搅拌发生酰胺化反应，反应结束后透析除杂，冻干，之后加入pva水溶液，混合发生硼酯键反应即可得到创面愈合用水凝胶。

8、在本发明的一种实施方式中，4-arm-peg-sg浓度为0.3-1g/ml，3-氨基苯硼酸的浓度为0.0009-0.002g/ml。

9、在本发明的一种实施方式中，所述酰胺化反应在ph＝8-9的环境下进行。

10、在本发明的一种实施方式中，所述酰胺化反应在20-25℃反应3-5h。

11、在本发明的一种实施方式中，所述透析除杂是指3500透析袋透析5-7天，每天换水1～3次。

12、在本发明的一种实施方式中，所述冻干是冷冻干燥，冻干处理能够有效降低凝胶内杂质，提高凝胶的纯度。

13、在本发明的一种实施方式中，所述pva水溶液中pva的质量分数为10～20％，可以是10％、15％或20％。

14、在本发明的一种实施方式中，所述硼酯键反应温度为20-25℃，反应时间为18～30h，优选为24h。

15、在本发明的一种实施方式中，优选加入分子量30000的20％ pva溶液和/或分子量200000的10％pva溶液。当加入的为分子量30000的20％ pva溶液、4-arm-peg-nhs、3-氨基苯硼酸及pva摩尔比为3：4000：13时，制备得到的是短期缓释凝胶，当加入的是分子量200000的10％pva溶液、4-arm-peg-nhs、3-氨基苯硼酸及pva摩尔比为3：4000：6时，得到的是长期缓释凝胶；当分别加入分子量30000的20％ pva溶液和分子量200000的10％pva溶液时，可分别获得具备短期缓释、长期缓释功能的双层修复性凝胶。

16、第二方面，本发明提供一种短期释药凝胶层的制备方法，所述制备方法包括：先将4-arm-peg-sg和3-氨基苯硼酸溶解于水中，并搅拌发生酰胺化反应得到接枝3-氨基苯硼酸的4-arm-peg-sg，反应结束后透析除杂，冻干；然后将接枝3-氨基苯硼酸的4-arm-peg-sg溶于水中制成接枝3-氨基苯硼酸的4-arm-peg-sg溶液，再将功能性物质加入到接枝3-氨基苯硼酸的4-arm-peg-sg溶液中，搅拌均匀后，滴加30000分子量20％pva溶液，搅拌凝胶即可得到短期释药凝胶层。

17、在本发明的一种实施方式中，所述功能性物质可以为具备抗炎功效或具备修复功效的物质。优选为具备抗炎功效的物质，更优选为具有抗炎功效的api-ils包裹缓释囊。

18、在本发明的一种实施方式中，所述具有抗炎功效的api-ils包裹缓释囊的制备方法，所述方法包括：利用双氯芬酸和肉碱制备得到具有抗炎功效的活性成分离子液体(api-ils)；将明胶和api-ils搅拌溶解在水中得到混合溶液；再将得到的混合溶液滴入含有span的大豆油溶液中搅拌乳化一定时间，之后将乳化后的两相混合物进行冰浴，加入戊二醛，反应后加入丙酮终止反应，将混合物进行固液分离、洗涤后烘干即可得到具有抗炎功效的api-ils包裹缓释囊。

19、在本发明的一种实施方式中，所述具有抗炎功效的api-ils包裹缓释囊是由明胶、span80、大豆油及api-ils利用乳化溶剂蒸发法制作成包裹api-ils明胶微粒，其中，所述api-ils是将双氯芬酸和肉碱质量比为2：1，在乙醇溶液中溶解后，在70℃搅拌12-24小时得到的。

20、在本发明的一种实施方式中，所述具有抗炎功效的api-ils包裹缓释囊的制备方法中，具体步骤包括：利用双氯芬酸和肉碱制备得到具有抗炎功效的活性成分离子液体(api-ils)；将明胶和api-ils在90-100℃下搅拌溶解在水中得到混合溶液；将得到的混合溶液滴入含有0.5-1％span大豆油溶液中搅拌乳化10-20分钟；随即乳化后的两相混合物，冰浴1-2小时，加入戊二醛；在得到的混合物中加入丙酮停止反应，将混合物进行固液分离、洗涤后烘干。

21、在本发明的一种实施方式中，所述具有抗炎功效的api-ils包裹缓释囊的制备方法中，所述具有抗炎功效的api-ils是将双氯芬酸和肉碱质量比为2：1，在乙醇溶液中溶解后，在70℃搅拌12-24小时得到的；所述明胶浓度20～60wt％，可以是20％、40％或60％，优选为20％。所述明胶和api-ils的质量/摩尔比为1：30-1：40；所述将得到的混合溶液滴入含有0.5-1％span大豆油溶液时的水油体积比为1:6～8，可以是1：6、1：7、1：8，优选为1:7。

22、在本发明的一种实施方式中，所述功能性物质(如，具有抗炎功效的api-ils包裹缓释囊)的加入量为总凝胶质量的7.5％～10％，优选为7.5％。

23、在本发明的一种实施方式中，所述的4-arm-peg-nhs、3-氨基苯硼酸及pva摩尔比为3：4000：13。

24、在本发明的一种实施方式中，所述4-arm-peg-nhs的分子量为100000～200000。

25、在本发明的一种实施方式中，4-arm-peg-sg浓度为0.3-1g/ml，3-氨基苯硼酸的浓度为0.0009-0.002g/ml。

26、在本发明的一种实施方式中，所述pva水溶液中pva的质量分数为10～20％，可以是10％、15％或20％。

27、在本发明的一种实施方式中，所述硼酯键反应温度为20-25℃，反应时间为18～30h，优选24h。

28、本发明所涉及的短期释药凝胶层在5mg/ml葡萄糖和1nmolm mmp-9存在下，缓释药物时间为4.5天，可在创面愈合前期抑制炎症，同时分子量为30000质量浓度20％的pva配比凝胶自适应性高、机械性能低，能够更好贴合创面的复杂环境。同时，所述凝胶层可对mmp-9发生响应。

29、第三方面，本发明提供了上述制备方法制备得到的短期释药凝胶层。

30、第四方面，本发明提供了一种长期释药凝胶层的制备方法，所述长期缓释修复性凝胶层的制备方法包括：先将4-arm-peg-sg和3-氨基苯硼酸溶解于水中，并搅拌发生酰胺化反应得到接枝3-氨基苯硼酸的4-arm-peg-sg，反应结束后透析除杂，冻干；然后将接枝3-氨基苯硼酸的4-arm-peg-sg溶于水中制成接枝3-氨基苯硼酸的4-arm-peg-sg溶液，然后将功能性物质加入到接枝3-氨基苯硼酸的4-arm-peg-sg溶液中，混溶后，将分子量200000质量分数10％pva滴入后快速搅拌凝胶即可得到长期释药凝胶层。

31、在本发明的一种实施方式中，所述的4-arm-peg-nhs、3-氨基苯硼酸及pva摩尔比为3：4000：6。

32、在本发明的一种实施方式中，所述功能性物质可以为具备抗炎功效或具备修复功效的物质。优选为具备修复功效的物质，更优选为修复性肽。

33、在本发明的一种实施方式中，所述修复性肽优选为修复性八肽，序列为kkiiiikk。

34、在本发明的一种实施方式中，所述功能性物质占长期缓释修复性凝胶总质量的0.75％-1.5％。

35、在本发明的一种实施方式中，所述硼酯键反应温度为20-25℃，反应时间为18～30h，优选24h。

36、本发明中的长期缓释修复性凝胶的是要期限为13天，可以做到药物长达13天的缓释效果可以逐步修复糖尿病复杂创面环境，同时较之上述的短期释药抗炎凝胶，其机械性能更高，可以应对更复杂的外部环境。

37、第五方面，本发明提供了上述制备方法得到的长期释药凝胶层。

38、第六方面，本发明提供了一种葡萄糖和mmp-9基质酶双响应的层层释药水凝胶，包括上述短期释药凝胶层和长期释药凝胶层。

39、在本发明的一种实施方式中，所述短期释药凝胶层的功能性物质为具有抗炎功效的api-ils包裹缓释囊；所述长期释药凝胶层的功能性物质为修复性肽。

40、第七方面，本发明提供上述葡萄糖和mmp-9基质酶双响应的层层释药水凝胶在制备糖尿病创面修复药物中应用。

41、在本发明的一种实施方式中，当施药时，优选将抗炎层放置在创面处(修复层则远离创面处)。

42、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

43、本发明创造性地开发了一种葡萄糖和mmp-9基质酶双响应的层层释药水凝胶，该水凝胶依据糖尿病创面的高葡萄浓度和高mmp-9表达，调控凝胶对于葡萄糖的敏感性，达到不同缓释药物速度，应对不同创面阶段，达到层层释药，达到“先抗炎后修复”一体化糖尿病创面愈合的效果。