含有至少2个硫原子的杂环化合物在制备纳米疫苗中的应用及制得的纳米疫苗的制作方法

本发明涉及免疫治疗或疫苗防治，尤其涉及含有两个或两个以上硫原子的杂环化合物在制备纳米疫苗中的应用及制得的纳米疫苗。

背景技术：

1、近年来，免疫疫苗的研制与开发在对于癌症及病毒感染的综合防治上已取得显著性进展，并在抗肿瘤或抗病毒感染的方面具备较高的临床应用价值。目前，各国已相继开发各类抗肿瘤或抗病毒疫苗用于疾病预防或治疗且已进入临床i、ii期，有些已被美国和欧洲获批用于临床。然而此类疫苗在激发抗原呈递细胞成熟与增强交叉呈递方面仍面临一些挑战，例如简单混合的佐剂与抗原制剂被树突状细胞摄入效率不高，且被摄入的抗原或佐剂在进入胞内溶酶体等细胞器后，更易被酶降解而降低或失去对树突状细胞的激活，进而减弱抗原交叉呈递效应，无法有效激活机体免疫系统应对外界或体内肿瘤或病毒侵染，更无法应对特定类型肿瘤或病毒感染。

2、高效的抗原呈递及其激活免疫系统，发挥免疫调节作用，主要依赖于抗原呈递细胞是否能够高效摄入抗原，是否能被有效激活而发挥其对抗原的交叉呈递作用。现有纳米疫苗主要以胞吞-溶酶体途径进入树突状细胞内，即在被树突状细胞内吞后，会形成内吞小体或小泡，再与胞内溶酶体融合，而溶酶体内的核酸酶或蛋白水解酶会剪切或水解纳米疫苗释放出的核酸佐剂或抗原肽，降低核酸佐剂对树突状细胞的刺激与促激活作用，影响其对抗原肽的交叉呈递作用，与对未成熟t淋巴细胞的激活与促增殖作用，减弱机体对抗原肽所产生的细胞免疫应答，导致肿瘤免疫治疗效果差。

3、近年来，基于脂质体包埋技术开发的脂质体mrna或多肽疫苗虽能在一定程度上降低溶酶体内酶体对其有效成份的降解，但仍然依赖于内吞-溶酶体途径摄入淋巴细胞内，无法躲避溶酶体内酶对其降解作用；且由于脂质体表面聚乙二醇能够有效抵抗或阻碍巨噬细胞等淋巴细胞对其内吞，进而降低了对抗原的摄取效率及淋巴细胞的激活比例，从而降低对抗原的交叉呈递作用。因此，迫切需要开发一种新的抗原摄取与呈递模式用于高效激活淋巴细胞与提高交叉呈递效率。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供含有二硫键的杂环化合物在制备纳米疫苗中的应用及制得的纳米疫苗，将硫醇类化合物与肿瘤新生多肽抗原或病毒多肽抗原以核酸佐剂，通过静电力，氢键与范德华力作用制备合成纳米疫苗，该疫苗能通过跨膜途径高效率进入树突状细胞胞质内部而降低其内部多肽抗原与核酸被溶酶体内蛋白酶或核酸酶降解。

2、本发明提供了式i化合物在制备纳米疫苗中的应用；

3、a-l-f

4、式i

5、其中，a为含有两个或两个以上s原子的杂环基；

6、l为无或为中间连接基团；

7、f为能够与多肽以共价或非共价连接的基团。

8、式i化合物中含有至少两个硫原子，其能够与核酸佐剂及新生抗原肽自组装形成的纳米疫苗。其中f基团与多肽连接，而a基团与细胞膜间进行硫醇交换，并介导纳米疫苗跨膜直接进入树突状细胞质。这种进入细胞内的方式不经胞吞-溶酶体途径，当其进入细胞后，在树突状细胞质中电解质缓冲液作用下，解体而释放其中的核酸佐剂与新生抗原肽。其释放的核酸佐剂能更有效的刺激树突状细胞成熟，增强树突状细胞对新生抗原肽的交叉呈递作用，增强对未成熟的t淋巴细胞的激活与促增殖能力，增强机体对新生抗原肽表达的肿瘤细胞特异性细胞免疫应答，增强t细胞依赖的肿瘤特异性细胞免疫治疗。

9、在本发明中，a中所述杂环基为4～8元环。

10、一些实施例中，所述a为：

11、在本发明中，l为-(ch2)n-、其中n＝1～5；r为-h、c1～5的烷基、m＝1～50。

12、一些实施例中，所述l为：

13、在本发明中，共价连接方式可选自：点击化学反应、交联反应；非共价连接的方式包括：静电作用、疏水相互作用、亲和作用。

14、其中，可通过点击化学反应与多肽连接的f基团包括：

15、

16、可通过交联反应与多肽连接的f基团包括：

17、

18、可通过其他反应方式与多肽形成共价连接的f基团包括：

19、

20、可通过静电相互作用与多肽连接的f基团包括：

21、

22、可通过疏水相互作用与多肽连接的f基团包括：

23、

24、可通过亲和作用与多肽连接的f基团包括：

25、

26、一些实施例中，所述f为：

27、一些实施例中，所述a为l为f为一些具体实施例中，所述式i化合物为

28、本发明提供的式i化合物都可以用于与多肽制备纳米颗粒，但实验表明，针对不同的多肽需要选择不同结构的式i化合物，否则形成的颗粒粒径过大，不能被细胞摄取。

29、本发明还提供了一种纳米颗粒，其原料包括式i化合物，核酸佐剂和抗原肽；

30、a-l-f

31、式i

32、其中，a为含有两个或两个以上s原子的杂环基；

33、l为无或为中间连接基团；

34、f为能够与多肽以共价或非共价连接的基团。

35、在本发明中，所述抗原肽选自肿瘤抗原、细菌抗原或病毒抗原。

36、本发明中，所述肿瘤抗原为肿瘤新生抗原，选自膀胱癌、血癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、中枢神经系统癌症、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胆囊癌、胃肠道癌、外生殖器癌、泌尿生殖道癌、头癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、肌肉组织癌症、颈癌、口腔或鼻黏膜癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、脾癌、小肠癌、大肠癌、胃癌、睾丸癌和/或甲状腺癌的新生抗原；

37、本发明中，所述病毒抗原为流感病毒抗原、埃博拉病毒抗原、冠状病毒抗原、肝炎病毒抗原、、腮腺炎病毒抗原、水痘-带状疱疹病毒抗原、麻疹病毒抗原、风疹病毒抗原、流感病毒抗原和/或禽流感病毒抗原；

38、所述冠状病毒为新型冠状病毒covid-19、sars病毒；所述肝炎病毒为甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒；所述流感病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒，其中甲型流感病毒的血凝素突起的类型包括h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14或h15，神经氨酸酶突起类型为n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8或n9。

39、本发明中，所述细菌抗原为结合分枝杆菌抗原、葡萄球菌抗原、链球菌抗原、肺炎双球菌抗原、炭疽杆菌抗原、白喉杆菌抗原、变形杆菌抗原、百日咳杆菌抗原、霍乱弧菌抗原、脑膜炎双球菌抗原和/或伤寒杆菌抗原。

40、在一些具体实施例中，所述肿瘤抗原为肝癌抗原，具体为肝癌h22多肽抗原，更具体的，其抗原序列为htdahaqafaalfdsmh。所述病毒抗原为冠状病毒抗原，具体为新型冠状病毒抗原；更具体的，其抗原序列为syysllmpi、ryvlmdgsi、ayansvfni、tyasalwei或gylkltdnv。

41、本发明实施例中，所述抗原的等电点＜6.5。

42、本发明实施例中，所述核酸佐剂为cpg-odn、poly i:c。

43、在本发明中，在多肽抗原的n端添加cy3荧光基团，在核酸佐剂的3’端标记fam荧光基团。荧光基团用于定位纳米疫苗在树突状细胞中的位置。而实验表明添加荧光基团与否对于激活效果并无显著影响。

44、本发明实施例中，所述的纳米颗粒中，式i化合物，核酸佐剂和抗原肽的摩尔比为(50～100):(0.5～1):(20～50)。在一些具体实施例中，纳米颗粒中，式i化合物，核酸佐剂和抗原肽的摩尔比为50:0.5:20。

45、本发明所述纳米颗粒，通过带正电荷的式i化合物中的胍基与带负电荷的核酸佐剂中的磷酸根形成盐桥，并再与带负电荷的新生抗原肽的氨基酸，通过分子间的静电力相互作用，自组装制备合成。其中，核酸佐剂可以是cpg-odn(鼠源或人源)，也可以是poly i:c(鼠源或人源)；新生抗原肽的等电点(pi)小于6。

46、一些实施例中，所述纳米颗粒的制备方法包括：纳米疫苗制备方法：将式i化合物，核酸佐剂和多肽抗原与tm缓冲液(ph 7.4)混合，37℃，100rpm搅拌15min，后在去离子水中透析，制得含有纳米颗粒溶液。

47、式i化合物，核酸佐剂和多肽抗原溶液总体积与所述tm缓冲液的体积比为1:60～70。

48、具体实施例中，146.2mm的式i化合物甲醇溶液、100mm的核酸佐剂溶液、2.5mg/ml的多肽抗原溶液，按照体积比为1:1:1的比例混合，然后混合液总体积60～70倍的tm缓冲液(ph 7.4)混合。

49、本发明还提供了一种纳米疫苗，其包括本发明所述的纳米颗粒和疫苗中可接受的辅料。

50、所述疫苗中可接受的辅料包括：溶剂、渗透压调节剂。优选的，本发明制备的纳米疫苗包括本发明所述的纳米颗粒与氯化钠注射液。

51、本发明中所述纳米疫苗通过硫醇交换介导的跨膜方式被摄入树突状细胞质内，并因胞质内缓冲液而解体释放多肽抗原、核酸佐剂，进而辅助并高效激活树突状细胞，提高其抗原交叉呈递作用，有效激活cd8+t细胞。

52、本发明还提供了一种抗肿瘤的方法，其为给予本发明所述的纳米疫苗。

53、本发明还提供了一种抗病毒和/或细胞感染的方法，其为给予本发明所述的纳米疫苗。

54、本发明涉及免疫治疗或疫苗防治技术领域，尤其涉及含有两个或两个以上硫原子的杂环化合物及其制备纳米疫苗中的应用。本发明提供了含有至少两个硫原子且能够与多肽以共价或非共价连接的杂环化合物在制备纳米疫苗中的应用。该化合物与核酸佐剂、抗原自组装制得纳米颗粒。该纳米颗粒能够通过跨膜方式进入树突状细胞质内，提高对抗原及免疫佐剂的摄取效率。由于在进入细胞的过程中，能有效躲避或降低溶酶体内酶体对抗原或核酸佐剂生物降解，故而本发明的纳米疫苗能够高效激活树突状细胞，并提高对抗原的交叉呈递作用，进而有效激活cd8+t细胞，并促进t细胞增殖。因此，本发明的纳米疫苗能够利用高效的免疫激活与免疫调节作用预防肿瘤细胞增殖与病毒感染。