一种组合物在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用

本发明属于生物医药，涉及一种组合物在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用,是一种由细胞膜表面受体拮抗剂普乐沙福、道诺霉素、阿糖胞苷和维奈托克组合的组合物在制备杀伤体外培养急性髓系白血病细胞效力的药物中的应用。

背景技术：

1、急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia,aml)是有一种具有显著异质性且高度致死的恶性肿瘤，严重的威胁着老年人的健康。标准治疗方法是道诺霉素和阿糖胞苷联合化疗。然而，只有60-80％的患者达到缓解，长期总生存率低于50％。口服bcl2小分子拮抗剂venetoclax与dna低甲基化剂地西他滨或低剂量化疗剂阿糖胞苷联合用于提高成人患者的治疗效果，并已获得美国食品和药物管理局(fda)的批准。最近，venetoclax加入强化化疗，在成人aml患者中获得了超过80％的高缓解。最近研究表明道诺霉素、阿糖胞苷和venetoclax(dav方案)在先前未经治疗的aml中实现了91％的复合完全缓解率、深度缓解和骨髓抑制的快速恢复，这为dav方案在新诊断的成年aml患者中的应用提供了证据。然而，研究中具有欧洲白血病有利风险和短期随访的患者比例较高可能导致了对dav方案有效性的高估。因此，对dav方案治疗机制和辅助靶点的研究还有待进一步深入。dav方案中的道诺霉素是dna拓扑异构酶ii抑制剂，阿糖胞苷可以抑制dna和rna聚合酶的功能阻断dna合成，而只有维奈托克是具有靶向性的bcl-2抑制剂。bcl-2是控制细胞凋亡内在(线粒体)途径的bcl2家族成员。其抑制剂已经在多种肿瘤中被使用，维奈托克以其优秀的特异性使得副作用相对较小而被应用在aml的治疗中。目前有不少研究旨在提高基于维奈托克治疗方案的疗效。有研究发现靶向另一bcl2家族成员mcl-1可使aml患者对维奈托克再次增敏。此外，一些研究者证明靶向内在凋亡通路的核心的线粒体结构可能使aml对维奈托克治疗更加敏感。还有靶向受体酪氨酸激酶mer家族成员axl也被证明可以根除患者的原始aml细胞(cd34+)，并协同使这些细胞对维奈托克更加敏感。何种方法可以辅助aml患者高反应率的dav方案提高患者的反应率仍然需要探索。

2、由于肿瘤的基因组差异和细胞组分差异可被用于预测预后和指导治疗方案的选择。解析肿瘤组分及其tme有助于dav方案分子机制的探索。单细胞技术是解析肿瘤组分的利器。例如，van galen等使用单细胞转录组测序(scrna-seq)和单细胞基因分型联合机器学习的方法解析了aml的转录组异质性和肿瘤细胞层次构成，并识别了一系列恶性细胞类型，为aml的精准医疗和免疫治疗提供了潜在靶点。andy g.x.zeng等以利用scrna-seq解析出的aml细胞组成为参考图谱进一步应用在bulk转录组数据上获取大量已知临床信息的aml患者的肿瘤细胞层次构成，将层次构成与患者对化疗或靶向治疗的反应、基因组和临床特性图谱关联起来，为aml的治疗提供了新思路，这些研究都展现出scrna-seq测序在推进aml精准医疗方面的优势，并显示了机器学习技术在肿瘤研究中的应用潜力。

3、目前治疗白血病最常见的方法之一便是化疗，但是很多的有基础疾病的老年患者无法承受化疗的强度，且会有化疗导致的死亡。dav方案的使用可以显著提高这类患者的生存。但仍然有部分患者对这种方案没有反应。因此，探索和发展辅助dav方案治疗白血病具有重大需求。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种组合物在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用，其中组合物由cxcr4的拮抗剂普乐沙福、道诺霉素、阿糖胞苷、维奈托克按照浓度(nm)为10:1:1:1组合。

2、所述白血病细胞为aml细胞系molm13，其体外培养基为添加20％胎牛血清(fetalbovine serum,fbs)的α-mem，体外培养条件为37℃、5％ co2培养箱。

3、所述组合物中cxcr4拮抗剂普乐沙福在体外培养细胞中的添加浓度为10nm，所述道诺霉素、阿糖胞苷、维奈托克的浓度分别为1nm。

4、本发明组合物与体外培养的aml细胞系molm13共孵育，通过采用cck-8法和流式细胞分析技术测试了cxcl12存在的条件下，本发明组合物与dav方案药物对于aml细胞体外杀伤作用的比较,结果显示本组合物可以显著提高对aml细胞的杀伤。

5、本发明靶点的发现具体通过以下方法实现：

6、(1)从已发表的文章中获取5例健康人的骨髓10x genomics平台3，端v3的scrna-seq测序数据，和我们测序的10例aml患者在dav方案治疗前后的骨髓scrna-seq数据进行整合。根据降维聚类后cluster中患者的细胞与健康人群的骨髓细胞的占比区分出normal-like(类正常)细胞和aml-like细胞。对于肿瘤微环境中的正常细胞，利用经典的细胞marker定义出细胞类型；

7、(2)下载van galen et al文献的12例aml患者的aml细胞scrna-seq数据，按照andy g.x.zeng et al文章重新分类并进行模型训练，利用迁移学习的算法将我们数据中10对aml患者的aml-like细胞进行分类，比较对dav方案有不同反应的aml患者的aml-like细胞组分在治疗前后的差异；结果显示对dav方案有反应患者在治疗后的primitive类型肿瘤细胞比例降低，而mono类型的肿瘤细胞比例上升；

8、(3)将样本按照对dav方案的反应性和治疗状态合并为有反应治疗前，有反应治疗后，不反应治疗前和不反应治疗后。将scanpy对象转化为dgcmatrix并分别创建cellchat对象，根据cellchat计算细胞间互作的标准pipeline，通过比较配体受体对相关的信号通路活性，比较配体-受体相互作用的概率，探索受细胞互作影响使aml患者对dav方案反应差异的可能分子机制，结果显示对dav方案不反应的患者肿瘤微环境中位于肿瘤细胞的cxcr4和基质细胞分泌的cxcl12的互作明显强于对dav方案反应的患者；

9、(4)应用aml细胞系验证使用cxcr4的拮抗剂与dav方案的药物组合是否可以增强对于aml细胞的杀伤作用：取对数生长的molm13细胞离心计数后，用培养基将细胞重悬为105/ml，按照不同的处理条件加入dav和普乐沙福检测细胞活力，细胞凋亡和cfu形成。细胞活力：将molm13细胞按照每孔100μl种入96孔板，药物处理24h后450nm测定吸光度，检测细胞活力。细胞凋亡：将molm13细胞与不同条件的药物共孵育48h后在细胞悬液中加入annexinv和pi，孵育20min后，在fitc和pe通道中进行流式细胞术检测。对于髓样分化，用cd11b和cd14抗体染色。针对白血病干细胞，采用cd34、cd38、tim3、cd99及人谱系(cd3、cd14、cd19、cd20、cd56)染色。使用cytoflex lx,beckman流式细胞仪采集细胞数据。cfu形成：molm13细胞在处理12小时后取1000个细胞接种在甲基纤维素培养基(h4034,stem celltechnologies,inc.)中，共三个重复，10d后在显微镜下对培养板进行菌落计数。结果显示cxcr4抑制剂和dav方案药物的组合提高了对aml细胞的杀伤作用。

10、本发明进行的单细胞转录组测序，通过降维聚类和机器学习识别出不同类型的免疫微环境细胞和肿瘤细胞类型，通过细胞间互作研究发现在经过药物治疗前，dav方案杀伤的主要肿瘤细胞类型与免疫微环境中的基质细胞间的cxcl12-cxcr4互作在对dav方案不反应的患者中更强。本发明组合物依此在维奈托克和阿糖胞苷以及道诺霉素组合的基础上加上cxcr4的抑制剂，通过实验证明本发明组合物相对于现有的dav药物组合能更加显著的的提高aml细胞的凋亡(图3a)，以及凋亡细胞中干祖细胞的比例(图3b，肿瘤干祖细胞与患者的不良干预后相关)，同时相对于现有的dav方案在cxcl12存在的情况下，aml细胞会对药物的杀伤产生抗性，而本发明组合物可以逆转这种抗性(图6，在体内aml细胞与微环境中的基质细胞互作是通过其上的cxcr4受体与基质细胞分泌的cxcl12配体)。