一种负载骨髓间充质干细胞的3D打印骨缺损修复支架及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物材料，具体涉及一种负载骨髓间充质干细胞的3d打印骨缺损修复支架及其制备方法和应用。

背景技术：

1、骨缺损是指骨骼由于遭受外伤、感染、肿瘤或其他疾病等原因造成的部分骨组织缺失。在健康人群中，当骨骼发生较小的骨缺损时，骨组织可以自然愈合。当骨组织缺失范围达到临界骨缺损长度时，这便超出了骨组织自行修复的能力范围，需要进行手术干预修复这段缺损的骨组织。在骨组织工程技术中，支架材料、种子细胞、生长因子是其重要的三要素。种子细胞是骨缺损修复的主力军，常用的种子细胞有胚胎干细胞、羊膜干细胞、脐带血干细胞、骨髓间充质干细胞等,它们都具有多向分化的潜能，但是现有研究表明骨髓间充质干细胞(bmscs)具有来源更广泛、取材更方便、不会与患者发生免疫排斥反应等优势，在未来可能成为治疗骨科相关疾病的最佳选择。支架材料是供种子细胞附着、生长和分化的三维立体框架，通过与机体系统的相互作用，能够直接影响骨组织缺损的修复进程和修复效果。

2、现有的研究结果表明，支架材料的孔隙率与孔径大小在骨形成中起着重要的作用。当支架材料的孔隙率在60％～80％时是比较理想的状态，其不仅可以调控自身降解的速度，还能促进种子细胞的黏附、增殖与分化。支架材料的大孔结构(孔在100～800μm之间)有利于血管和新骨形成，小孔结构(孔径在10～100μm之间)有利于细胞生长，微孔结构(孔径在10μm以下)有利于液体的渗透。

3、凹凸棒土(att)是一种粘土矿物，主要成分为坡缕石(palygorskite)或坡缟石，是一种富镁硅酸盐，属于2：1型层链状晶体多孔结构，由于其本身独特的微观结构和性质，赋予凹土许多优良性能，如吸附性、粘结性、催化性等，在食品、化工和生物医药领域得到广泛应用。但现有技术中将凹凸棒土应用到3d打印骨缺损修复支架的研究较少。

4、基于上述理由，提出本技术。

技术实现思路

1、基于上述理由，针对现有技术中存在的问题或缺陷，本发明的目的在于提供一种负载骨髓间充质干细胞的3d打印骨缺损修复支架及其制备方法和应用，解决或至少部分解决现有技术中存在的上述技术缺陷：本发明可以解决现有骨缺损修复材料生物活性及骨诱导性能较差的技术问题。

2、本发明的第一方面提供了一种负载骨髓间充质干细胞的3d打印骨缺损修复支架的制备方法，包括以下步骤：

3、(1)按配比将纳米β-磷酸三钙、或纳米β-磷酸三钙与微米级凹凸棒土加入到预混匀的光敏树脂体系中，将所得混合浆料混匀，避光脱泡处理后经3d打印光固化成型，获得多孔支架，洗净，干燥，脱脂烧结；

4、(2)将步骤(1)经脱脂烧结处理后的多孔支架消毒，然后将骨髓间充质干细胞悬浮液以一定浓度接种于所述多孔支架上，使用含10％fbs的h-dmem培养基培养1-2周后取出，脱细胞处理后冻干，获得所述的负载骨髓间充质干细胞的3d打印骨缺损修复支架。

5、进一步地，上述技术方案，步骤(1)中所述微米级凹凸棒土的尺寸为15-30μm。

6、进一步地，上述技术方案，步骤(1)中所述混合浆料优选包括纳米β-磷酸三钙和微米级凹凸棒土。

7、进一步地，上述技术方案，步骤(1)中所述纳米β-磷酸三钙和微米级凹凸棒土的质量比为95-105：1。

8、进一步地，上述技术方案，步骤(1)中所述光敏树脂体系包括光敏树脂、光引发剂和分散剂。

9、更进一步地，上述技术方案，所述光敏树脂为1,6-己二醇二丙烯酸酯(hdda)、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(tmpta)和di-tmpta其中一种或几种。

10、更进一步地，上述技术方案，所述光引发剂为tpo或tpo-l。

11、更进一步地，上述技术方案，所述分散剂为byk-103、byk-110、oa或聚丙烯酸铵其中一种或几种。

12、进一步地，上述技术方案，步骤(1)中，在本发明的一个优选实施例中，所述混合浆料的混匀方式为球磨混匀，所述球磨混匀具体是按照一定级配配好氧化锆球，然后将所述混合浆料与锆球混合，球磨后筛出球磨珠即可。

13、更进一步地，上述技术方案，在本发明的一个优选实施例中，所述锆球与混合浆料的球料比为2:1。

14、更进一步地，上述技术方案，所述球磨速度为100-500rad/min，所述球磨时间为5-15h；在本发明的一个优选实施例中，所述球磨速度为300rad/min，在本发明的一个优选实施例中，所述球磨时间为12h。

15、进一步地，上述技术方案，步骤(1)中所述混合浆料的固含量为30vol％～40vol％。

16、进一步地，上述技术方案，步骤(1)中所述脱脂烧结的具体工艺如下，先在300-600℃条件下保温30-60min，然后升温至1000-1500℃保温90-180min。

17、更进一步地，上述技术方案，所述脱脂烧结采用的升温速率为0.5-2℃/min。

18、进一步地，上述技术方案，步骤(2)中所述bmscs细胞悬浮液的浓度为1～2*106/ml。

19、本发明采用的各原料在本发明中所起的作用如下：

20、本发明采用的纳米β-磷酸三钙含钙、磷元素，是骨活性材料，可起到诱导骨再生作用；并且，本发明采用的纳米β-磷酸三钙呈弱碱性，可中和病灶ph值，降解的钙离子可用于骨形成的原材料；纳米β-磷酸三钙还可刺激bmscs细胞分泌骨再生相关因子如bmp2等。

21、本发明采用的凹凸棒土中的多孔结构可以吸附bmscs细胞分泌的骨再生相关因子，起到缓释作用，持续诱导骨再生。并且，凹凸棒土还负责富集保存因子，也可增强磷酸钙的力学强度、调节降解速率，bmscs在磷酸钙的环境中可以往骨组织方向分化，产生骨形成相关的生长和营养因子。

22、本发明的第二个目的在于提供上述所述方法制备得到的负载骨髓间充质干细胞的3d打印骨缺损修复支架。

23、本发明的第三个目的在于提供上述所述方法制备得到的3d打印骨缺损修复支架在rbmscs成骨分化方面的应用。

24、本发明的第四个目的在于提供上述所述方法制备得到的3d打印骨缺损修复支架在骨缺损的治疗方面的应用。

25、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

26、(1)本发明利用光固化成型技术(sla)制备一种负载骨髓间充质干细胞的3d打印骨缺损修复支架，该方法具有独特优势：光固化成型法是最早出现的快速原型制造工艺，成熟度高，经过时间的检验，其原理是聚合物的光引发聚合交联反应；且其由cad数字模型直接制成原型，加工速度快，产品生产周期短，无需切削工具与模具；本发明方法可以根据需求加工结构外形复杂或使用传统手段难于成型的原型和模具；且发明方法可联机操作，可远程控制，利于生产的自动化。

27、(2)本发明上述步骤(1)制备的多孔支架结构，特别是凹凸棒土/β-磷酸三钙骨支架材料的多孔结构，不仅影响着骨髓间充质干细胞的黏附、迁移和增殖等生物学行为，更能刺激bmscs分泌骨再生相关生长因子并吸附在凹凸棒土中，起装载和保护作用，增强材料的骨诱导生物活性，加速骨的形成。因此，本发明所制备的负载骨髓间充质干细胞的骨缺损修复支架理化和生物学性能优异，有望作为一种生物学性能优异的骨修复材料，用于生物医学领域。