Fc结合肽偶联物、靶向TROP2的定点偶联ADC及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医药，尤其涉及一种fc结合肽偶联物、靶向trop2的定点偶联adc及其制备方法和应用。

背景技术：

1、抗体偶联药物(antibody drug conjugates，adcs)主要由连接片段偶联抗体和小分子细胞毒药物组成，以抗原靶向性的抗体将小分子细胞毒成分特异性地运输到肿瘤组织并释放，发挥杀伤癌细胞的作用。在adc的设计中，抗体的选择决定靶向性，小分子细胞毒成分决定杀伤能力，连接片段的设计(亲水性)和偶联方法的优化影响adc的均一性、稳定性。

2、trop2(tumor-associated calcium signal transducer 2)，又名tacstd2(tumor-associated calcium signal transducer)、egp-1(epithelial glycoprotein-1)、ga733-1(gastrointestinal tumor associated antigen)，是一类由tacstd2基因编码的细胞表面单次跨膜糖蛋白。在64％肺腺癌(doi:10.18632％2foncotarget.15647)、78.1％三阴性乳腺癌(doi:10.3892/or.2018.6496)中观察到高trop2表达，与肿瘤生长、癌转移以及患者的不良预后相关。靶向trop2的抗体偶联药物在抗肿瘤领域的应用已得到初步论证，目前有immunomedics(已被gilead收购)的trodelvy(sacituzumab govitecan，研发代码为immu-132)上市，获批适应症为三阴性乳腺癌和尿路上皮癌。在研管线中，科伦博泰的skb264采用了巯基与磺酰基嘧啶接头(sulfonyl pyrimidine-cl2a-carbonatelinker)，避免了retro-michael反应并提高了adc的血浆稳定性，目前处于三阴性乳腺癌适应症的临床iii期，并在同适应症上获得fda突破性疗法资格(doi:10.3389/fonc.2022.951589)；第一三共株式会社的datopotamab deruxtecan(研发代码为ds-1062、dato-dxd)采用了与恩曲妥珠单抗相同的ggfg四肽可裂解连接子以及dxd毒素，改善了adc的均质性，提高了体内外血浆稳定性并有效延长了血浆半衰期(dato-dxd at 6mg/kg vsimmu-132 at 8mg/kg,45.12±13.92 vs 14.4±3.3)，目前处于肺癌适应症的临床iii期(doi:10.1158/1535-7163.mct-21-0206)；恒瑞医药的shr-a1921采用了四肽可裂解连接子以及自主研发的shr9265毒素，目前处于临床i/ii期(doi:10.1158/1538-7445.am2023-lb030；doi:10.1158/1538-7445.am2023-ct181)；君实生物/多禧生物的js108(研发代码或为dac-002)仅披露了使用微管蛋白抑制剂tub196作为毒素，目前处于临床i期；启德医药的gq1010采用了基于sortase a转肽酶定点偶联的ildc平台技术，改善了adc的均质性，同时在偶联位点采取了自水解开环的马来酰亚胺结构(doi:10.1038/nbt.2968)，减少了retro-michael反应带来的血浆稳定性不足的问题，目前处于临床前研究(doi:10.1158/1538-7445.am2023-1549)。除js108/dac-002使用微管蛋白抑制剂tub196作为毒素之外，已披露(部分)结构的trodelvy、skb264、datopotamab deruxtecan和shr-a1921均采用了半胱氨酸偶联(cysteine-based coupling)的策略，将喜树碱类药物(sn38、t-030/kl610023、dxd、shr9265)作为小分子毒素部分，dar值(drug-to-antibody ratio，药物抗体比)分别为7.6、7.2、4、4。除科伦博泰的skb264之外，其他半胱氨酸偶联策略合成的抗体偶联药物，由于tcep等还原剂无法区分还原位点、不同位点反应性不同等原因造成均质性不足、adc产物聚集稳定性差，对adc生产工艺要求较高；且在血液循环过程中存在不同程度的硫代琥珀酰亚胺(thiosuccinimide group)的retro-michael反应断裂(doi:10.1016/j.ddtec.2018.07.002)、导致细胞毒素在血浆中提前释放，临床试验中的药物治疗窗有限。

3、adc药物的安全性、有效性有望通过均质性更高、稳定性更好的定点偶联技术得到进一步的提升。

4、在抗体fc片段铰链区、ch2和ch3区域之间，抗体能够与至少4种天然蛋白骨架(protein a、protein g、类风湿因子、fcrn)发生蛋白-蛋白相互作用。利福尼亚大学旧金山分校的delano推测fc上存在一保守区域能够与特定多肽结构高度亲和，在2000年利用噬菌体展示技术体外分筛多肽、辅助多肽-fc片段结晶论证，探索得到包含13个氨基酸残基dcawhlgelvwct-nh2的多肽序列fc-iii(doi:10.1126/science.287.5456.1279)。基于此项工作，日本鹿儿岛大学的伊藤教授开发了ccap(chemical conjugation by affinitypeptide)法、首先将fc结合肽应用于抗体定点偶联物的合成，通过优化多肽序列筛选得到一段17个氨基酸残基的fc结合环肽的序列(gpdcayhkgelvwctfh-nh2)，并在多肽的n端偶联biotin或毒素小分子dm1、用赖氨酸上修饰的nhs酯将fc结合肽定点定量地偶联到抗体上(doi:10.1021/acs.bioconjchem.8b00865)。这类多肽能够在ph 5.5-8.0的宽ph范围内实现曲妥珠单抗k248位点的定点偶联，但残留在adc上的fc结合肽可能影响部分抗体功能，导致抗体无法结合到fcrn上、难以纯化。日本的味之素公司在专利(jp2018017345/ca3061467a1)中进一步优化了环肽的序列(ac-rgncayhrgklvwctyh-nh2)，2019年山田慧等人通过在linker中引入二硫键(doi:10.1002/anie.201814215)、实现定点偶联后的fc结合肽在tcep的还原下脱除，而遗留的k248位巯基残基可以通过与马来酰亚胺的micheal加成反应，实现毒素小分子与抗体的定点偶联。2022年，上海药物所的黄蔚课题组改良了fc结合肽与抗体fc片段的分子作用机制(doi：10.1002/anie.202204132)，实现了一步无痕定点偶联，通过硫酯的转氨基反应，将毒性小分子或生物正交官能团偶联到曲妥珠单抗的k248位上，实现抗体的定点偶联。

技术实现思路

1、本发明的技术目的是提供一种fc结合肽偶联物，其可以实现对抗体k248位点的赖氨酸残基的定点偶联。

2、本发明提供的一种fc结合肽偶联物，其结构如式(i)或式(ii)所示：

3、

4、其中，多肽链的序列为rgncayhrgklvwctyh，其中两个巯基之间形成二硫键；w1为硫酯；

5、r1选自以下基团：

6、

7、w1选自以下基团：

8、n＝0-6；

9、w2选自以下基团：

10、n1＝0-36；

11、x或xl选自以下基团：

12、

13、m、n2＝0-36；

14、y1为-vc-、-va-、-ggfg-、-fk-等短肽，选自以下基团：

15、

16、y2选自以下基团：

17、

18、l或l1为生物正交官能团，选自以下基团：

19、m1、n3＝0-36；

20、z为药物活性成分；

21、以上，代表连接位点。

22、如式(i)结构的fc结合肽偶联物为式(i')或式(i")所示：

23、

24、如式(ii)结构的fc结合肽偶联物为式(ii')或式(ii")所示：

25、

26、所述的fc结合肽偶联物由fc结合域配体(多肽链)、硫酯(w1)、功能性官能团(x)包含亲水官能团peg链或/与生物正交官能团l1、可裂解片段(y1、y2)、药物活性成分z等多部分组成。

27、优选的，所述的fc结合肽偶联物选自以下化合物：

28、

29、

30、

31、

32、所述的药物活性成分为小分子毒素、parp抑制剂、atm抑制剂、免疫激动剂或荧光基团。

33、优选的，所述的z选自美登素、一甲基澳瑞他汀e(mmae)、一甲基澳瑞他汀f(mmaf)、一甲基澳瑞他汀d(mmad)、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、依托泊苷(vp-16)、喜树碱、dxd、7-乙基-10-羟基喜树碱(sn-38)、依喜替康(exatecan)、托泊替康(topotecan)、吡咯并苯并二氮杂卓(pbd)二聚体、紫杉醇、多烯紫杉醇、埃博霉素a、埃博霉素b、诺考达唑、秋水仙碱、雌莫司汀、西马多订、艾榴塞洛素、奥拉帕尼(olaparib)衍生物、azd5305衍生物、azd1390衍生物、吡咯并嘧啶骨架的免疫激动剂、香豆素、bodipy、cy7、biotin等。

34、进一步优选的，所述的z选自：

35、

36、

37、其中，代表连接位点。

38、所述的fc结合肽偶联物经多肽链合成、多肽链n端修饰、脱树脂、氧化成环得到环肽，再经酰胺缩合修饰linker-l1或linker-z，构成具有偶联反应活性的fc结合肽偶联物(式i、式ii)。

39、本发明的另一技术目的是提供一种靶向trop2的定点偶联adc，如式(iii)或式(iv)所示：

40、

41、其中，抗体为靶向trop2的抗体；

42、w2、x、xl、y1、y2、l、z的定义分别与上述相应定义相同。

43、其中，-nhw2x(l)y1y2z为-nhw2xy1y2z或-nh(x)l为-nhl或-nh xl。

44、优选的，靶向trop2的抗体(裸抗)选自自主表达靶向trop2的蛋白sac-a，或商业化的靶向trop2的蛋白sacituzumab、datopotamab；

45、自主表达靶向trop2的蛋白sac-a轻链的氨基酸序列如seq id no.1所示，自主表达靶向trop2的蛋白sac-a重链的氨基酸序列如seq id no.2所示；

46、靶向trop2的蛋白sac-a轻链质粒的核苷酸序列如seq id no.3所示，靶向trop2的蛋白sac-a重链质粒的核苷酸序列如seq id no.4所示；

47、sacituzumab和datopotamab可通过商业化购买获得。

48、sacituzumab轻链和重链的氨基酸序列参见：https://www.kegg.jp/entry/d10984；

49、datopotamab轻链和重链的氨基酸序列参见：https://www.kegg.jp/entry/d12360。

50、优先的，所述的靶向trop2的定点偶联adc选自以下化合物：

51、

52、

53、

54、

55、

56、所述的靶向trop2的定点偶联adc是基于fc结合肽偶联物导向的k248位定点偶联的新型抗体-药物偶联物。本发明的另一技术目的是提供所述靶向trop2的定点偶联adc的制备方法，包括：将如式(i)或式(ii)所示的fc结合肽偶联物与靶向trop2的裸抗进行反应，生成如式(iii)或式(iv)所示的靶向trop2的定点偶联adc。

57、如式(i)所示的fc结合肽偶联物与靶向trop2的裸抗进行反应，生成如式(iii)所示的靶向trop2的定点偶联adc，反应如下：

58、

59、如式(iii)所示的定点偶联adc的制备流程如图1。包括如下步骤：

60、经多肽合成得到的肽链p1-resin，用r1-oh(羧酸)或r12o(酸酐)封闭肽链p1-resin的n端后得到肽链p2-resin，再脱树脂得到游离的肽链p2；将肽链p2经氧化形成二硫键得到环肽p3，所述的环肽p3具备与fc结构域特定位点配位的能力；

61、药物活性成分z(s1)经多步酰胺缩合得到药物连接子活性酯(s3)，再通过与w2-nhs反应将药物连接子活性酯末端nh2修饰转化为末端cooh(s4)并进一步修饰得到活性酯(s5)，活性酯与w1-cooh含硫linker经酯化反应得到硫酯(s6)，并进一步活化硫酯c端后得到含巯酯的活性酯(s7)；

62、环肽p3的赖氨酸残基与含巯酯的活性酯(s7)反应得到如式(i)所示的fc结合肽偶联物(p6，即式i)，该fc结合肽偶联物(p6，即式i)具备在抗体(ab)的fc结构域上引入毒素小分子或特殊反应性基团的功能；

63、如式(i)所示的fc结合肽偶联物(p6)通过与抗体(ab)fc结构域的特定位点发生配位，在w1的硫酯键发生转酰基反应，定点修饰抗体k248位点的赖氨酸残基，得到如式(iii)所示的定点偶联adc(adc，即式iii)。

64、如式(ii)所示的fc结合肽偶联物与靶向trop2的裸抗进行反应，生成如式(iv)所示的靶向trop2的定点偶联adc，反应如下：

65、

66、如式(iv)所示的定点偶联adc的制备流程如图2。包括如下步骤：

67、经多肽合成得到的肽链p1-resin，用r1-oh(羧酸)或r12o(酸酐)封闭肽链p1-resin的n端后得到肽链p2-resin，再脱树脂得到游离的肽链p2；将肽链p2经氧化形成二硫键得到环肽p3，所述的环肽p3具备与fc结构域特定位点配位的能力；

68、生物正交官能团l(s8)经nhs或sulfo-nhs修饰后得到含生物正交官能团的活性酯(s9)，活性酯(s9)与一端为巯基、另一端为cooh的w1-cooh含硫linker经酯化反应得到关键中间体(s10)，并进一步修饰得到含巯酯的活性酯(s11)；

69、环肽p3的赖氨酸残基与含巯酯的活性酯(s11)反应得到如式(ii)所示的fc结合肽偶联物(p7，即式ii)，该fc结合肽偶联物(p7，即式ii)具备在抗体(ab)的fc结构域上引入毒素小分子或特殊反应性基团的功能；

70、如式(ii)所示的fc结合肽偶联物(p7)与抗体(ab)fc结构域的特定位点发生配位、在w1的硫酯键发生转酰基反应，定点修饰抗体k248位点的赖氨酸残基，得到如式(iv)所示的靶向trop2的定点偶联adc(adc，即式iv)。

71、上述多肽链(p)和药物连接子(s)的合成策略可进行适当调整。

72、本发明还提供了如式(iii)所示的定点偶联adc的另一种制备方法，包括如下步骤：

73、经多肽合成得到的肽链p1-resin，用r1-oh(羧酸)或r12o(酸酐)封闭肽链p1-resin的n端后得到肽链p2-resin，再脱树脂得到游离的肽链p2；将肽链p2经氧化形成二硫键得到环肽p3；环肽p3通过与trt保护的巯基乙酸(或trt保护的巯基丙酸等)发生酰胺缩合得到p4，再脱trt基团得到环肽p5，环肽p3、p4、p5均具备与fc结构域特定位点配位的能力；

74、环肽p5的末端巯基与活性酯(s5)直接反应得到如式(i)所示的fc结合肽偶联物(p6，即式i)；

75、如式(i)所示的fc结合肽偶联物(p6)通过与抗体(ab)fc结构域的特定位点发生配位、在w1的硫酯键发生转酰基反应，定点修饰抗体k248位点的赖氨酸残基，得到如式(iii)所示的的定点偶联adc(adc，即式iii)。流程如图3。

76、本发明还提供了如式(iv)所示的定点偶联adc的另一种制备方法，包括如下步骤：

77、经多肽合成得到的肽链p1-resin，用r1-oh(羧酸)或r12o(酸酐)封闭肽链p1-resin的n端后得到肽链p2-resin，再脱树脂得到游离的肽链p2；将肽链p2经氧化形成二硫键得到环肽p3；环肽p3通过与trt保护的巯基乙酸(或trt保护的巯基丙酸等)发生酰胺缩合得到p4，再脱trt基团得到环肽p5，环肽p3、p4、p5均具备与fc结构域特定位点配位的能力；

78、环肽p5的末端巯基与活性酯(s9)直接反应得到如式(ii)所示的fc结合肽偶联物(p6，即式ii)；

79、如式(ii)所示的fc结合肽偶联物(p7)通过与抗体(ab)fc结构域的特定位点发生配位、在w1的硫酯键发生转酰基反应，定点修饰抗体k248位点的赖氨酸残基，得到如式(iv)所示的的定点偶联adc(adc，即式iv)。流程如图4。

80、本发明的另一技术目的是提供一种靶向trop2的翻译后修饰定点偶联adc，如式(v)或式(vi)所示：

81、

82、其中，抗体为靶向trop2的抗体；

83、w2、y1、y2的定义分别与上述相应的定义相同；

84、z、z1、z2独立地为药物活性成分；

85、l1和l2是一对生物正交官能团，当l1＝la时，l2＝lb；当l1＝lb时，l2＝la：

86、

87、m1、n3＝0-36；

88、x、x1、x2选自以下基团：

89、其中m、n2＝0-36；

90、以上，代表连接位点。

91、当z1＝z2时，偶联后修饰的靶向trop2的定点偶联adc(式v)的dar值从2增加为4，dar值增加；z1≠z2时，偶联后修饰的靶向trop2的定点偶联adc(式v)为双药adc。

92、优选的，所述的翻译后修饰的定点偶联adc选自以下化合物：

93、

94、

95、

96、式(iii)或式(iv)所示化合物与偶联生物正交官能团l2的linker-drug(s14)反应引入毒素小分子，得到如式(v)或式(vi)所述的定点偶联毒素小分子的adc。如式(v)或式(vi)所述的化合物的制备方法分别如图5、图6。

97、优选的，偶联生物正交官能团l2的linker-drug(s14)选自以下化合物：

98、

99、

100、

101、

102、本发明的另一技术目的是提供一种切除不均一糖链的靶向trop2的定点偶联adc，如式(vii)、式(viii)、式(ix)或式(x)所示：

103、

104、式(vii)、式(viii)、式(ix)和式(x)中，-r'为-w2xy1y2z、-(x)l、-w2x1(l1l2x2y1y2z2)y1y2z1和-l1l2xy1y2z；

105、其中，抗体为靶向trop2的抗体；

106、w2、x、x1、x2、y1、y2、l、l1、l2、z、z1、z2的定义分别与上述相应定义相同。

107、-w2x1(l1l2x2y1y2z2)y1y2z1为-(x)l为-l或-xl。

108、如式(vii)、式(viii)、式(ix)或式(x)所示的化合物分别是通过如式(iii)、式(iv)、式(v)或式(vi)所示的化合物与糖苷内切酶endo s或endo s2反应切除不均一糖链而得到。反应过程如下：

109、

110、本发明的另一技术目的是提供一种双偶联策略的抗体-药物偶联物，如式(xi)、式(xii)或式(xiii)所示：

111、

112、

113、式(xi)、式(xii)或式(xiii)中，-r'为-w2xy1y2z、-(x)l、-w2x1(l1l2x2y1y2z2)y1y2z1或-l1l2xy1y2z；

114、其中，抗体为靶向trop2的抗体；

115、w2、x、x1、x2、y1、y2、l、l1、l2、z、z1、z2的定义分别与上述相应定义相同，z3为药物活性成分；

116、w3选自以下基团：

117、n1＝0-36。

118、如式(xi)所示化合物是通过如式(iii)、式(iv)、式(v)、式(vi)、式(vii)、式(viii)、式(ix)或式(x)所示的化合物以糖定点偶联的方式与linker-drug发生偶联反应得到；

119、如式(xii)所示化合物是通过如式(iii)、式(iv)、式(v)、式(vi)、式(vii)、式(viii)、式(ix)或式(x)所示的化合物以赖氨酸随机偶联的方式与linker-drug发生偶联反应得到；

120、如式(xiii)所示化合物是通过如式(iii)、式(iv)、式(v)、式(vi)、式(vii)、式(viii)、式(ix)或式(x)所示的化合物以半胱氨酸随机偶联的方式与linker-drug发生偶联反应得到。

121、本发明的另一技术目的是提供一种如式(iii)-式(xiii)所示的化合物在制备抗肿瘤治疗的药物中的应用。

122、所述的用于抗肿瘤治疗的药物可以用于治疗乳腺癌、尿路上皮癌、肺癌或胰腺癌。

123、本发明的另一技术目的是提供一种如式(iii)-式(xiii)所示的化合物在制备免疫治疗的药物中的应用。

124、所述的用于免疫治疗的药物可以为用于抗炎症、抗病毒、抗感染性疾病，或用于治疗上述多种癌症。

125、所述的药物可联合放疗或联合pd-l1/pd-1治疗上述多种癌症。

126、本发明的另一技术目的是提供一种如式(iii)-式(xiii)所示的化合物在制备放射增敏剂、肿瘤靶标检测试剂或体内外诊断试剂中的应用。

127、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

128、本发明基于fc结合肽靶向抗体fc结构域的lys定点偶联技术，通过在linker中引入生物正交官能团(叠氮官能团、dbco、bcn、tco或tz)作为二次偶联位点、实现多种作用机制的药物组合，以抗体偶联双药的形式实现多种不同作用机制的小分子药物联用。不同抗体具有保守的fc结构域，fc定点偶联策略的兼容性好、不影响产物adc对抗原的靶向性，偶联工艺稳定、对自主表达的抗体和商业化的抗体均有良好的适用性。

129、本发明采用了fc结合肽导向的定点偶联方法改善靶向trop2-adc的均质性，用dar值为2-4的mmae毒素联合parp抑制剂提供抗肿瘤活性，期望提高靶向trop2-adc候选药物的有效性。通过在linker中修饰peg等亲水官能团，降低linker-drug的疏水性、提高adc的聚集稳定性，降低其毒性反应。