一种生物膜的快速制备方法及其应用与流程

本技术属于医疗器械，尤其涉及一种生物膜的快速制备方法及其应用。

背景技术：

1、据临床数据表明，心血管疾病是人类的第一大杀手。该疾病往往与血管狭窄或阻塞有关，这就会导致血流量减少和组织损伤。据预测，到2030年，全世界心血管疾病相关死亡率的年发病率将上升至2330万人。

2、当前，心血管疾病的治疗方法往往包含两个方面:1.改善膳食和生活方式:2.药物和外科手术。如果病情发展到需要进行血管手术，则可能涉及血管内手术，如血管成形术，血管内支架植入或粥样斑块切除术，以扩大狭窄血管或清除梗阻。或者使用血管移植物来绕过或直接代替受损或阻塞的血管。因为动脉的可用性有限，而且与静脉相比，其具有更产重的并发症，此外，自体血管的可用性有限，同时质量不可控，而且会导致供体部位的发病。

3、鉴于上述提到的自体血管的局限性，组织工程血管移植物的出现为血管移植手术的未来提供了一个更完善的潜在解决方案。研究人员尝试使用患者的自体细胞或干细胞来源的自体细胞，并结合生物支架来构建组织工程血管移植物。组织工程化仿生血管的构建需要三个基本组件:细胞、支架和适当的信号因子。将细胞接种到可生物降解的支架上，为新发展的组织提供临时支撑和结构性指导，同时使用生物力学和生物化学条件来刺激和影响适当的细胞行为。

4、组织工程的细胞支架不但起着决定新生组织、器官形状大小的作用，更重要的是为细胞增殖起着提供营养、进行气体交换、去除废物，为细胞增殖、繁衍提供场所的重要作用。为了保证细胞的生长繁殖不受支架存在的影响，还要求细胞支架的降解速度能同细胞的增殖速度相匹配、并且其降解产物不会对细胞的生长和繁殖产生不利的影响。

5、从临床实用要求考虑，在手术操作中能保持原有的形状和结构;并且具有一定的柔韧性、能同机体组织相缝合和能同机体组织相贴合，能经受手术操作而不破碎、并不对机体组织造成机械损伤的力学性能。因此作为组织工程的细胞支架必须同时满足生物相容性、细胞亲和性、生物降解性，以及力学性能和形态结构等性能要求。

6、自体移植物、同种异体移植物和异种移植物已经发展到替代受损血管。由于血栓形成，小直径移植物(d < 6mm)仍存在挑战。机械性能、形貌、微观结构和降解行为都会影响细胞行为，并决定修复血管的质量。通过静电纺丝、盐析、或相分离技术制备多孔血管移植物以促进组织向内生长，定向生长被引入到结构中以诱导对齐的内皮和平滑肌细胞；然而，这些研究大多局限于模拟天然动脉的螺旋多层分级结构。因此，研究与开发组织工程血管是当前大趋势，目前最受关注的脱细胞支架材料，却因在脱细胞过程中细胞外基质成分丢失殆尽，对种子细胞黏附功能差，此外，因为脱细胞过程使支架中的胶原纤维疏松，各种生物基团暴露，而存在生物学和力学性能下降，降解过快，易于钙化等缺点；这些缺点对于组织工程细胞的构建和应用都是非常致命的。合成高分子材料：涤纶、聚四氟乙烯（ptfe）、聚氨酯（pu）、聚己内酯（pcl），聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）等先后被应用于人工血管的研发。这类材料具有来源可控、质量稳定性高、加工简单及机械性能好等优点，目前对这类材料的研究与改良是热点方向；缺点主要是制作过程复杂，细胞在管壁上的粘附和生长较慢。

7、目前人造血管在生物相容性、血栓、免疫排斥等方面已经取得很好的效果，但是人造血管的力学性能都依赖于材料的物理性能，与天然血管的差异仍然存在，导致二者对接处愈合延迟、错配效应、术后并发症等不良影响；人工血管与天然血管顺应性不匹配时，将引起血管移植部位血液动力学的变化，在吻合口处易导致血栓形成和血管内膜增生。血栓形成会导致血管在短期内发生阻塞；而内膜过度增生是影响移植血管远期通畅率的主要因素。

8、cn 107648669 a公开了一种构建血管化组织工程骨膜的方法，具体步骤如下：步骤1 .运用静电纺丝方法制备高分子微/纳米纤维膜；步骤2 .接种种子细胞至纳米纤维膜上，在体外培养并定向诱导一段时间；步骤3 .将体外定向诱导一段时间后的种子细胞/纳米纤维膜复合体植入体内，经过一段时间的体内血管化后取出，得到组织工程骨膜；缺陷：种子细胞来源受限，必须是自体细胞，否则有免疫排斥。

9、cn 112156229 a公开了一种新型小直径可降解人工血管及其构建方法，包括内表面纤维层、外表面纤维层和缠绕于内表面纤维层的纤维上的螺旋支撑结构，该人工血管制备方法简便，能一步制备出双层取向性静电纺丝纤维构成的小直径人工血管，通过几何图案信号作用，使人工血管内能快速形成取向排列且稳定黏附的单层内皮细胞，诱导平滑肌细胞呈圆周取向排列生长的同时具有更佳的力学性能，帮助人工血管内组织再生及功能的稳定再建；缺陷：人工材料无法像细胞质基质一样完全模拟细胞周围微环境，营养、支撑、酸碱度等方面不如原始的细胞质基质。

10、cn 107648669 a公开了一种构建血管化组织工程骨膜的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）静电纺丝制备高分子微/纳米纤维膜；（2）接种种子细胞至纳米纤维膜上，在体外培养并定向诱导一段时间；（3）将体外定向诱导一段时间后的种子细胞/纳米纤维膜复合体植入体内，经过一段时间的体内血管化后取出，得到组织工程骨膜。虽然本方法能有效减少自体组织的排斥反应并大大增加组织工程骨膜的血管化程度，但是该方法使用范围单一，生产周期长，临床实用性差，不能在短时间内减少病人痛苦。

11、cn 105816915 a公开了一种间充质干细胞组织工程支架及其制备方法和在制备皮肤替代品中应用。本发明的制备方法包括：制备明胶-壳聚糖多孔支架，然后将间充质干细胞接种至明胶-壳聚糖多孔支架，并进行孵育培养。虽然本发明的间充质干细胞组织工程支架能够明显有效地促进糖尿病等皮肤难愈合创面的再生、重构、修复与愈合。但是还存在以下缺陷，细胞未经过脱细胞处理，存在排斥反应；制备过程复杂，制备过程所受的影响因素太多，如：温度、ph值等，不能批量生产。

12、cn1386478a 公开了一种组织工程用复合结构细胞支架及其制法和用途，提供了一种适用于多种细胞组织工程细胞支架的复合结构细胞支架，虽然力学性能、降解速度、三维形态结构有所改善，但是仍存在异体免疫排斥反应，同时支架降解的产物会导致毛细血管堵塞。

13、制备过程复杂，成本高昂，不能批量生产，也无法满足临床个性化、多样化的实际需求。

技术实现思路

1、本技术公开一种生物膜的快速制备方法及其应用，有效解决人工血管治疗效果差，血栓形成、异体排斥反应、生产效率低、适用范围窄等问题，为了实现上述目的，本技术的技术方案是：提供了一种生物膜的快速制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2、（1）将聚氨酯溶于n,n-二甲基甲酰胺中，获得聚氨酯溶液；采用溶液流延法，真空条件下烘干获得聚氨酯膜；通过物理冲孔方式，制备多孔聚氨酯膜，经胶原蛋白修饰，获得胶原蛋白修饰的多孔聚氨酯膜；在无菌条件下，配制人体细胞培养液；将胶原蛋白修饰的多孔聚氨酯膜平铺在人体细胞培养液中，培养条件37 ℃, 5% co2 ，1-3小时贴壁，经过2-5天培养获得生物膜；

3、（2）对生物膜进行脱细胞处理，处理后对其进行附着生长因子处理；

4、（3）生物膜裁剪；

5、（4）生物膜缝制：缝制成单层或多层生物膜。

6、为更好地实现本发明，进一步的，所述生物膜为可降解生物膜或不可降解生物膜。

7、为更好地实现本发明，进一步的，所述多层生物膜为降解生物膜、不可降解生物膜中的一种或多种。

8、为更好地实现本发明，进一步的，所述多层生物膜附着的生长因子为内皮生长因子、平滑肌细胞生长因子、成纤维生长因子中的一种或多种。

9、为更好地实现本发明，进一步的，所述人体细胞培养液包括dmem、维生素、无机离子、促生长因子、胶原蛋白、0.25%胰蛋白酶-edta 、10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗。

10、为更好地实现本发明，进一步的，所述聚氨酯溶液质量百分比为20%~40%。

11、为更好地实现本发明，进一步的，所述真空条件为-1 ~ -0.5kpa。

12、为更好地实现本发明，进一步的，所述多孔聚氨酯膜，孔为均匀孔、非均匀孔中的一种或多种组合，孔形状为规则形状、不规则形状中的一种或多种组合，规则形状为方形、圆形、椭圆形、多边形、心形、花瓣形中的一种或多种组合，孔尺寸为17~200μm，孔间距30~400μm。

13、为更好地实现本发明，进一步的，所述胶原蛋白修饰是将聚氨酯膜浸入浓度为3mgml-1的胶原蛋白溶液中，用uv灯照射，该灯的发射光谱在256 ~ 365nm之间。

14、为更好地实现本发明，进一步的，所述脱细胞处理是将生物膜放在浓度为0.25%~0.5%的十二烷基硫酸钠溶液中，经6-12小时取出，磷酸盐缓冲液中震荡清洗1-2h，在去离子水中清洗3次以上，获得脱细胞生物膜；脱细胞处理后，再对其进行附着内皮生长因子处理。

15、为更好地实现本发明，进一步的，所述生物膜的厚度为0.3-1mm。

16、为更好地实现本发明，进一步的，其特征在于作为人工血管、人工尿管、疝气修补片、心肌膜、食道、盆底膜、气管、伤口敷料中的应用。

17、与现有技术相比，本技术实施例的有益效果至少包括：

18、1）本技术提供的制备方法，利用微米级多孔的结构，可以为细胞提供附着点，具有促进细胞的粘附与增殖的作用，可以促进细胞迁移和组织向内生长；还可以使细胞生成的组织与聚氨酯膜牢固结合，使组织全方位包裹聚氨酯，不会发生副反应。

19、2）本技术提供的制备方法，操作过程简单，能快速大规模培养并量产，实现产业化，生产周期短，降低生产成本。

20、3）本技术提供的生物膜，应用性强，可操作性强，随用随取，医生可以根据病人病情，可以调整生物膜的层数，生物膜的形状、结构，及随意裁切生物膜的尺寸，通过蛋白线进行缝合。

21、4）通过调控网孔的大小，调控细胞质基质与聚氨酯膜的贴壁性及细胞与聚氨酯膜的嵌入性，进而调控生物膜的强度及力学性能；生物膜不仅保留其生物力学性能，同时避免同种免疫排斥反应。

22、5）多层使用时，可以根据病人情况进行结构调控，如三层膜：内层可使用内皮生长因子溶液浸泡，中间层使用平滑肌细胞生长因子溶液浸泡，外层使用成纤维生长因子浸泡。

23、6）将多孔结构的生物膜制备成血管，在承受压力变化时由于其多孔结构，血管内径、长度与体积的都会发生变化，其径向顺应性、纵向顺应性和体积顺应性也会相应增加，人工血管与天然血管顺应性相匹配，减少血管移植部位血液动力学的变化，在吻合口处降低血栓形成和血管内膜增生。

24、7）添加胶原蛋白，能刺激细胞增殖和迁移，促进胶原纤维的生成，胶原蛋白修饰后，水接触角由50°左右降低到10-20°，有助于良好的细胞粘附、诱导和增殖。

25、8）可降解生物膜与不可降解生物膜交替使用时，可降解生物膜当做临时填充物，不可降解生物膜可当做骨架，持续提供支撑性能。