斑马鱼评价蓝光视损伤的方法及其应用与流程

本发明涉及药物、保健食品、化妆品或医疗器械评价领域，尤其是涉及斑马鱼评价蓝光视损伤的方法及其应用。

背景技术：

1、伴随着时代的发展，人们对于超声显示器或电脑的时间越来越长，长时间使用会导致高度近视、玻璃体混浊、视疲劳患病率增加，视力越来越差。电子仪器散发处于400-500nm波长的蓝光辐射伴随着波长的减少，光子能量增加，对视网膜的损伤逐步加重。因此，亟需一种快速检测药物、保健食品、化妆品或医疗器械的抗蓝光改善视力损伤功效的方法。

2、视网膜血管很多，但主要提供营养是脉络膜。而脉络膜的损伤常常会导致视网膜变性改变和新生血管化。有证据表明，视网膜色素上皮变性与脉络膜毛细血管变性之间存在密切联系，表明视网膜色素上皮萎缩首先发生，进而诱发新生血管化。因此，脉络膜的血流量、血管形态对疾病的发生发展非常重要。

3、目前报道的改善视力损伤的成分主要为叶黄素、玉米黄质、花青素，主要的作用机制是抗氧化，在视网膜光损伤早期有明显的保护作用。但当损伤的时间过长、程度过重，进展到萎缩性黄斑变性时，尚无药物可以治疗。因此，选择一种合适的动物模型探究视力损伤的作用机制，开发防护视力损伤药物、保健食品、化妆品及医疗器械非常有必要。

4、大鼠、小鼠和兔都是常用的光损伤模型动物，通过循环光照和暗适应(至少7天)、调节光照强度和光照时间，诱导出视力损伤。大鼠视网膜的背中央区域被认为是人类视网膜黄斑的一个功能类似物，它是最锐利的视觉区域。例如，有学者使用蓝光照射大鼠，造模14天，每天12小时，给药21天，处理结束进行眼底照相和视网膜电图(erg)检测，统计视网膜杯盘比变化和erg振幅的变化；也有学者用蓝光照射大鼠1个月，每天12小时，处理结束用视网膜病理切片he染色检测视网膜结构变化；专利cn112451513a公开了丹酚酸a在制备防治可见光性视网膜损伤药物中的用途，利用蓝光损伤hrpe-19和bn大鼠，建立在体和体外模型，评价丹酚酸a对防治视网膜光损伤的效果。但是大鼠的光损伤模型实验成本较高，周期较长，尤其是erg的检测操作复杂、专业性要求高。小鼠实验成本较大鼠小，可显示出部分主要的黄斑变性特征，但小鼠适应性差、对环境要求条件较高，没有黄斑变性，只能评估光对整个视网膜的影响。兔的眼较大，便于手术和观察，兔与猴的视网膜损伤阈较近，可能更接近人的视网膜结构，但兔也没有黄斑。据此需要一种理想的解决方法。

技术实现思路

1、本发明为了克服光损伤模型实验成本高、周期长的问题，提供斑马鱼评价蓝光视损伤的方法及其应用，斑马鱼蓝光诱导的视力损伤模型，用凋亡细胞荧光强度、脉络膜血流速度、血流量、线粒体形态及ros水平表征视力损伤程度，建模快、通量高、成本低、预测性强。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、斑马鱼评价蓝光视损伤的方法，包括以下步骤：随机选取若干斑马鱼，对其进行蓝光照射，照射结束后，检测视力指标进行评价。

4、斑马鱼是脊椎动物，与人基因相似度高达87％。斑马鱼的眼部血管结构和视网膜结构与人高度相似，均由三种不同的胚胎组织发育而来的。神经外胚层产生神经视网膜、视网膜色素上皮、视杆、虹膜扩张器和括约肌以及睫状体；表面外胚层形成晶状体，随后形成结膜和角膜上皮；间充质来源于神经峭细胞，形成角膜内皮和基质、虹膜基质、睫状肌和血管以及巩膜。另外，斑马鱼没有眼睑，可用无创的方式用高速摄像头采集血细胞的位移，从而检测斑马鱼脉络膜的血流速度和血流量。脉络膜循环为视网膜提供营养并带走废物，当脉络膜血流下降时，代谢废物就会在光感受器细胞、bruch膜和视网膜色素上皮细胞内堆积，这些因素能够促使地图样萎缩的发生。增加脉络膜血流量可能帮助带走代谢产物，从而阻止黄斑变性的进展。通过评价脉络膜的血流速度和血流量开发新作用机制的成分防治蓝光诱发的视力损伤。而且，由于受精后5天(5dpf)内的斑马鱼幼鱼不需要进食，不属于动物，被欧盟认为在伦理学方面是可以接受，便被用于药物、保健食品及化妆品功效和安全性评价的替代实验。

5、作为优选，所述斑马鱼为野生型ab品系斑马鱼。

6、作为优选，所述斑马鱼为受精后1天(1dpf)的斑马鱼。

7、斑马鱼的眼睛形态发生始于受精后12小时(12hpf)。随后对眼睛原基的结构在24hpf时形成良好的视杯组织，且视网膜的神经发育从内部(玻璃体)到外部(巩膜)方向发展。首先形成视神经元(～32hpf)，并有少量神经节细胞(gc)在～34-36hpf形成视神经。而眼睛中光感受器(pr)的初始分化发生在～50hpf的视神经头腹侧贴片位置，贴片的发育会持续至～70hpf，此时整个视网膜结构看起来均匀一致。双极性细胞(bc)是最后一种在～60hpf下形成的细胞类型，在60-70hpf之间，其可以识别所有神经元细胞类型并且突触较其他神经元更加明显的。斑马鱼在72hpf有视觉反应，此时视网膜类似于成人视网膜形态，在解剖学(不同视网膜层的结构特征、细胞排列的相似性)和功能上均与人类相似，包含五种组织成层的神经类型。远端大多数是pr，位于外核层(onl)中，末端与外丛状层(opl)中的bc和水平细胞(hcs)形成突触。其余二级神经元的细胞体以及三级无核细胞(ac)的细胞体位于内核层(inl)中。许多发育转录因子，如锥杆同源盒基因(crx)，无调性(ath5)和甲状腺素β2核受体(trβ2)，它们是哺乳动物视网膜发育的关键，也在斑马鱼视网膜中起作用。尽管在大多数非哺乳动物脊椎动物谱系中保留了四色视锥系统，但视锥视蛋白基因表达的转录机制仍然难以捉摸，特别是对于sws2和rh2视蛋白，这两种细胞在哺乳动物谱系中都已丢失，但是斑马鱼仍然保留上述保守蛋白，同源性较其他动物更加匹配。因此，斑马鱼模型评价药物、保健食品及化妆品抗蓝光视力损伤功效也具有较好的预测性。

8、作为优选，所述蓝光的照射强度为100-200mw/cm2，单次照射连续7小时以上，累计照射时长为10-22h。

9、作为进一步优选，所述蓝光照射的方式为：在1dpf和2dpf分2天照射，每次7-10h，照射距离为5-10cm，温度为18-22℃，在3dpf时检测视力指标。

10、作为优选，所述检测指标包括眼凋亡细胞荧光强度、眼病理切片、脉络膜血流速度和血流量、线粒体含量测定或电镜线粒体变化中的至少一种。

11、作为优选，所述检测指标为眼凋亡细胞荧光强度，蓝光照射结束后进行染色处理，具体为：采用吖啶橙2-3μg/ml染色20-40min。

12、本发明还提供所述方法在药物、保健食品、化妆品或医疗器械的功效评价中的应用。

13、作为优选，斑马鱼的给药阶段为2-5dpf。

14、因此，本发明的有益效果为：目前的模型建模周期长(适应7天，造模14天以上，给药21天以上)、动物成本高、检测方法复杂，斑马鱼蓝光诱导的视力损伤模型，用凋亡细胞荧光强度、脉络膜血流速度和血流量表征视力损伤程度，建模快(可在3天内完成)、通量高(斑马鱼体积小，只有1-4mm，能在6孔板内甚至更小的孔板内进行分析，单人单日30个样品)、成本低、预测性强。