本发明属于生物，具体涉及一种联合多组学和孟德尔随机化识别膜性肾病关键治疗靶点的方法及其应用。
背景技术：
：：1、膜性肾病(membranous nephropathy，mn)是以肾小球基底膜(gbm)外侧、上皮细胞下免疫复合物沉积伴gbm弥漫增厚为特征的一组疾病。其典型的病理特征为：基底膜异常，免疫荧光igg伴或不伴c3沿基底膜沉积，上皮下电子致密物沉积。原发性mn(pmn)是构成中老年患者肾病综合征的常见疾病，发病高峰年龄为40～60岁。近年来，膜性肾病在国内发病率逐年增加且有年轻化趋势。2、mn的确切机制虽仍未被阐明，但经过近60年的不懈努力，己确立的经典理论是：肾小球足细胞上的抗原与其特异性抗体结合形成原位免疫复合物，后续激活补体引起损害，是本病发病的必备条件。最近的研究表明，70％的原发性mn患者血清中发现针对足细胞抗原pla2r的自身抗体。目前尚不清楚pla2r抗体如何产生以及原发性mn的始动因素，相应的动物模型也没有被成功建立。此外，大量的研究表明补体复合物c5b～9在mn中的致病作用不通过其细胞溶解作用，而主要通过激活足细胞来表现，包括诱导足细胞产生氧自由基，刺激足细胞产生各种蛋白酶，促进足细胞调亡、脱落等。3、目前的mn治疗方案主要包括免疫治疗和非免疫治疗。尿蛋白>3.5g/d的患者在评估危险因素后应给予免疫抑制治疗。2012年kdigo指南推荐治疗mn的一线方案为激素联合烷化剂，cni方案为一线替代方案。近年来也有多项研究尝试了不同的免疫抑制剂组合，但2019年kdigo会议进一步提出只有激素联合烷化剂方案有证据表明对延缓进入终末期肾病有效，其他的免疫抑制方案都只是以蛋白尿的下降为研究终点。4、总体而言，目前mn的发病机制和分子病理学变化尚未明确，疾病治疗的有效率仍然维持在50-60％，且对于一线治疗抵抗的患者缺乏足够的备选治疗方案，因此亟需新的作用靶点以推动治疗方案、治疗理念的进步。已有技术多采用单一的转录组学数据研究膜性肾病的发病机制和疾病状态，缺乏多维度数据的相互支持和印证。技术实现思路1、本发明的目的是针对现今膜性肾病治疗中药物种类单一，治疗有效率不足，药物副作用严重和有效靶点筛选困难的问题，提供了一种联合多组学和孟德尔随机化识别膜性肾病关键治疗靶点的方法及其应用。2、本发明是通过以下技术方案实现的：3、一种联合多组学和孟德尔随机化识别膜性肾病关键治疗靶点的方法，包括如下步骤：4、(1)转录组数据获取：5、从公共数据库geo中获取膜性肾病患者和健康移植肾的肾小球微阵列数据，下载数据集gse104948中来自欧洲肾cdna库受试者和活体捐赠者的肾小球表达矩阵，筛选出来自膜性肾病患者(n＝21)和健康捐赠者(n＝21)的样本用于后续分析；6、表达矩阵使用geo数据库提供的注释文件进行probe id-gene symbol转换；7、从gse171458中获取膜性肾病患者(n＝6)和健康对照受试者(n＝2)肾活检标本的单细胞rna测序数据；8、(2)差异基因鉴定：9、使用limma r包对微阵列转录组数据进行归一化和差异分析，log2倍数变化的绝对值(|log2fc|)大于1且p.adj小于0.05的基因被定义为差异表达基因(degs)；差异分析结果由r包ggplot2和complexheatmap进行数据可视化；10、(3)富集分析：11、对于微阵列数据差异分析得到的基因列表，在kobas网页工具中进行在线分析，使用r包clusterprofiler对单细胞rna测序拟时序分析产生的基因列表进行富集分析；12、r包fgsea被用于单细胞rna测序的基因集富集分析，通过该包计算归一化后的富集分数(nes)和p值并进行可视化，从ferrdb v2数据库获取铁死亡驱动剂的基因集；13、(4)免疫浸润分析：14、采用cibersort反卷积算法处理归一化后的肾小球微阵列表达矩阵，预测出正常和膜性肾病肾小球组织中各类免疫细胞的比例；15、具体而言，使用lm22特征矩阵和1000排列计数进行预测，执行分位数归一化并且仅保留预测结果p<0.05的样本进行后续分析；16、为保留的样本绘制每种免疫细胞所占比例在mn和健康组的箱线图，通过wilcox秩和检验比较其组间差异，使用spearman相关性系数评估特定细胞因子表达与免疫浸润间的相关性；17、(5)olink蛋白组学分析：18、olink标准差异分析使用student test检验计算实验不同条件下标准化npx数据的蛋白的表达差异，根据p-value<0.05条件筛选得到差异蛋白信息，根据此进行差异蛋白表达分析；19、(6)单细胞rna测序分析：20、1)数据处理和降维聚类：21、使用r软件包seurat从geo数据库中整合并分析6名mn患者和2名健康供者的scrna-seq图谱；22、经过严格的质量控制将所有细胞的nfeature限制在200～5000个之间，细胞的线粒体基因比例在50％以下，然后对过滤后的数据进行对数归一化；23、通过seurat函数findvariablefeatures选择降维基因，选择方法为“vst”；24、基因选择完成后，用scaledata对所有对数归一化表达值进行缩放，在降维过程中，选择前50个主成分(pcs)，随后基于r包harmony矫正了批次效应，使用seurat函数findallmarkers识别每簇细胞的标记；25、在singler包初始注释的基础上根据cellmarker2.0和panglaodb数据库中记录的标记最终确定细胞类型，基因在不同细胞类型中的平均表达量由averageexpression函数计算，并通过r包heatmap可视化；26、2)差异细胞类型丰度分析：27、使用r包milor对单细胞数据进行差异丰度测试；28、3)拟时序轨迹分析：29、使用r包monocle分别构建单核/巨噬细胞和内皮细胞的伪时间轨迹；4)细胞通讯分析和代谢分析：30、使用cellchat分析单细胞转录组的细胞间相互作用，不同细胞簇的代谢通路活性由r包scmetabolism基于vision算法计算；31、5)高维加权基因共表达网络分析(hdwgcna)32、使用r包hdwgcna执行高维加权基因共表达网络分析；33、(7)双向孟德尔随机化：34、为了估计模块基因表达水平与mn之间的因果效应，使用twosamplemr r包进行了双向mr分析；35、(8)数据分析：36、使用r 4.3.1进行上述生物信息学分析。37、进一步地，步骤(2)中所述的p值是经过benjamini-hochberg矫正得到调整后p值(p.adj)。38、进一步地，步骤(6)中的操作1)中所述的基因选择完成后，用scaledata对所有对数归一化表达值进行缩放，在降维过程中，选择前50个主成分(pcs)，随后基于r包harmony矫正了批次效应，为了便于可视化，使用均匀流形逼近和投影(umap)将细胞映射到二维平面上。39、进一步地，步骤(6)中的操作2)具体为：40、根据说明，使用buildgraph函数构建knn图，然后使用makenhoods函数定义邻域，其中k设置为40，d为20以确保邻域大小(neighbourhood size)的分布峰值在50～100之间，最后，进行差异丰度测试，比较大量蛋白尿组和非大量蛋白尿组肾组织的细胞类型丰度差异。41、进一步地，步骤(6)中的操作3)具体为：42、利用函数dispersiontable筛选拟时间分析基因(mean_expression≥0.1)，通过ddrtree将每个单细胞投影到树上，形成轨迹，轨迹的起点由cytotrace计算的细胞分化分数、差异丰度分析结果和生物学背景知识共同确定，使用函数differentialgenetest来识别和聚类参与细胞状态随拟时间演变的可变基因，使用分支表达分析建模(beam)算法鉴定细胞向不同命运(分支)分化过程中动态变化的基因。43、进一步地，步骤(6)中的操作5)具体为：44、对于单核/巨噬细胞，首先基于knn构造metacell对象，参数k＝5，可共享最大细胞数为10，每个metacell的最小细胞数为10，识别组别为拟时序分析鉴定的细胞状态；45、然后使用testsoftpowers函数计算得到的符号网络软阈值为12；对于内皮细胞，参数k＝25，可共享最大细胞数为10，符号网络软阈值为5；两种细胞的共同分析步骤包括构建共表达网络，聚类协同表达基因模块，计算eigengene-based connectivity(kme)以代表每个基因与模块的关联程度，和计算harmonized module eigengenes(hme)表征每个模块在单个细胞的特征值；46、最后使用moduletraitcorrelation函数将模块与临床特点相关联。47、进一步地，步骤(7)具体为：48、从公开的gwas数据库ieu opengwas和人类肾病综合征肾脏组织的eqtl图谱(nephqtl)获得模块基因的表达数量性状位点(eqtl)；为筛选合适的工具变量对eqtl进行了清洗；具体而言，连锁不平衡(r2>0.001，kb＝10000)或不满足全基因组显著性阈值(p≥5×10-8)的snps被排除；使用f统计量＝(β/se)2评估每个snp的工具强度，f统计量>10表明工具强大；从ieu opengwas中获得了膜性肾病队列的结局数据；纳入了不同人种的数据集：ebi-a-gcst010005(2150例病例和5829例对照，欧洲血统)，ebi-a-gcst010004(1632例病例和3209例对照，东亚血统)进行分析和验证；为了提高结果的准确性，仅报告使用多个工具变量进行分析的基因，并且在这一过程中采用逆方差加权(ivw)方法来评估是否存在暴露因素和结局之间的因果关系；并进行了异质性检验，以验证ivw方法的适用性以及确保所使用的工具变量的有效性；运用mr-egger截距测试评估数据的多效性；最后，为了评估特定基因表达水平和疾病之间是否存在反向因果关系，交换暴露和结局数据进行了反向孟德尔随机化分析。49、一种以铁死亡基因slc1a5作为膜性肾病治疗靶点的应用。50、本发明相比现有技术具有以下优点：51、1、本发明利用病人血清行olink蛋白组学分析，联合多组学和孟德尔随机化识别膜性肾病关键治疗靶点的方法；首次发现铁死亡基因slc1a5可以作为膜性肾病可能的治疗靶点。利用单细胞测序、蛋白质组学、转录组学、全基因组关联研究数据，从多组学角度阐述了膜性肾病的肾实质改变和炎症环境特点。52、2、本发明关注小管内皮细胞在膜性肾病中的改变和内皮-巨噬细胞相互作用，这有助于解释膜性肾病中足细胞抗原暴露的原因，进一步探索膜性肾病的始动因素。双向孟德尔随机化利用人类等位基因随机分配的原理，模拟随机对照试验，其结果最大限度的排除了混杂因素，可以说明因果联系及排除反向因果关系，比之前的生物信息学研究方法具有更强的证据等级。在这里，证明了slc1a5是膜性肾病的潜在致病基因，可能通过诱导内皮细胞铁死亡、促进炎症内皮细胞转变和足细胞抗原暴露引起疾病发生发展。肾小球内皮细胞铁死亡与膜性肾病的关系尚未有研究，确定了一个尚未报道的膜性肾病致病基因和一种新的机制，为膜性肾病的分子病理学研究提供新观点，为靶向slc1a5作为可能的mn治疗靶点提供了理论基础。当前第1页12当前第1页12