含间充质干细胞外泌体的猪纤维蛋白粘合剂及制备与应用的制作方法

本发明涉及生物医药，具体涉及一种含间充质干细胞外泌体的猪纤维蛋白粘合剂及其制备方法与应用。

背景技术：

1、皮肤是人体最大的器官系统，健康完整的皮肤在维持人体生理稳态方面起着至关重要的作用，皮肤受损后，加速皮肤组织再生、恢复受损皮肤功能，是皮肤组织再生修复的关键。

2、干细胞在组织修复与再生方面具有广阔的应用前景，已被广泛应用于转化医学领域。其中间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的多能干细胞，间充质干细胞可以从骨髓、肝脏、脾脏、外周血、脂肪、胎盘、脐带、脐血等组织中分离培养获得，因其具有分离方便、低免疫排斥性、可转分化能力，而被广泛运用于创面修复领域。过去人们一直认为间充质干细胞治疗疾病的机制是其到达损伤组织后快速增殖并分化、替代受损细胞。后来研究发现，间充质干细胞来源的外泌体具有抑制炎症、促进皮肤细胞增殖和血管再生、减少肌成纤维细胞积累的作用，表明间充质干细胞主要通过旁分泌方式修复损伤。

3、外泌体是一种由真核细胞的多泡内涵体与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的纳米量级的膜性小囊泡，可由多种类型细胞分泌，干细胞来源的外泌体是细胞旁分泌作用的关键介质，被供体细胞分泌出来后，可以被受体细胞所摄取，并将其内容物传递至受体细胞中，从而发挥生物学作用。间充质干细胞来源的外泌体治疗皮肤创面避免了干细胞治疗的免疫排斥、致瘤、栓塞等缺点，且具有稳定性高、无需增殖、储存方便、便于定量使用等优势，具有较高的安全性和较大的组织再生潜能。

4、皮肤创面愈合包括4个阶段：止血阶段、炎症阶段、增殖阶段和重塑阶段。这些阶段的生物过程紧密协调，以确保皮肤能够正常行使屏障功能，而外泌体在皮肤再生过程各个阶段中均发挥了重要作用。

5、目前，应用外泌体促进皮肤损伤修复的方法主要是局部注射和静脉注射；局部注射一般是将外泌体注射至创面的周围，并不能让外泌体直接、均匀地分布在创面上，而静脉注射则不能保证所有外泌体都参与皮肤修复，且外泌体在体内很快会被清除，难以维持较高浓度状态，需多次给药，造成外泌体的浪费。除此之外，注射的方法还会对皮肤造成二次伤害，给治疗带来一定的困难。

6、纤维蛋白粘合剂(fs，fibrin sealant)，主要由纤维蛋白原和凝血酶组成。纤维蛋白原经凝血酶激活形成纤维蛋白单体，进一步在凝血因子的参与下形成稳定的纤维蛋白多聚体，直接封闭所覆盖的组织，以达止血、粘合、封闭等作用。目前，市场上主要为人源和猪源的纤维蛋白粘合剂。因纤维蛋白粘合剂具有止血、粘合、封闭等作用，常辅助用于手术操作中的外科止血，也有产品可用于整形、烧伤、组织重建等外科领域，用于移植皮肤、皮瓣与皮下组织间的黏附，作为皮肤缝合的辅助，改善移植皮肤、移植皮瓣与皮下组织的粘合，促进愈合。但现有的纤维蛋白粘合剂作为可用于止血、密封和粘合三方面的产品，在促进皮肤修复方面略有不足。

技术实现思路

1、本发明的目的在于：针对现有纤维蛋白粘合剂在促进皮肤修复方面存在的不足，而设计了一种含间充质干细胞外泌体的猪纤维蛋白粘合剂，其将纤维蛋白粘合剂与间充质干细胞外泌体相结合，在实现增强移植皮肤、移植皮瓣与皮下组织粘合的同时，促进了皮肤组织的愈合及修复效果，解决了现有纤维蛋白粘合剂的不足。

2、本发明是通过如下技术方案实现的：

3、一种含间充质干细胞外泌体的猪纤维蛋白粘合剂，其是由猪纤维蛋白原溶液和猪凝血酶溶液混合得到；

4、所述的猪纤维蛋白原溶液由间充质干细胞外泌体和猪纤维蛋白原溶解于猪纤维蛋白原稀释剂中得到；其中：所述的猪纤维蛋白原稀释剂由氯化钠、枸橼酸钠、盐酸精氨酸、氨丁三醇、人血白蛋白、葡萄糖、复方电解质、复方氨基酸中的至少三种溶于水中得到；

5、所述的猪凝血酶溶液由间充质干细胞外泌体和猪凝血酶溶解于猪凝血酶稀释剂中得到；其中：所述的猪凝血酶稀释剂由氯化钙、枸橼酸钠、盐酸精氨酸、氨丁三醇、磷酸盐缓冲液、葡萄糖、复方电解质、复方氨基酸、谷氨酰胺中的至少三种溶于水中得到。

6、具体的，本发明提供的猪纤维蛋白粘合剂与间充质干细胞外泌体相结合，将其应用于整形、烧伤、结构重建等移植皮肤手术中，具有增强移植皮肤、移植皮瓣与皮下组织的粘合能力，同时又有促进皮肤组织愈合及修复的效果。

7、进一步的，一种含间充质干细胞外泌体的猪纤维蛋白粘合剂：所述猪纤维蛋白原稀释剂与所述猪凝血酶稀释剂的ph均为6.0～8.0；所述猪纤维蛋白原溶液与所述猪凝血酶溶液的体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。

8、进一步的，一种含间充质干细胞外泌体的猪纤维蛋白粘合剂：在所述猪纤维蛋白原溶液中所述间充质干细胞外泌体的浓度为10～1000μg/ml、所述猪纤维蛋白原的浓度为20～100mg/ml。

9、进一步的，一种含间充质干细胞外泌体的猪纤维蛋白粘合剂：在所述猪凝血酶溶液中所述间充质干细胞外泌体的浓度为10～1000μg/ml、所述猪凝血酶的浓度为4～100iu/ml。

10、进一步的，一种含间充质干细胞外泌体的猪纤维蛋白粘合剂：所述猪纤维蛋白粘合剂的成胶时间为60～600秒；所述猪纤维蛋白粘合剂的粘合力为100～1000g/cm2。

11、进一步的，一种含间充质干细胞外泌体的猪纤维蛋白粘合剂：所述的间充质干细胞外泌体的制备方法，依次包括如下步骤：

12、(1)在完全培养基中培养间充质干细胞，使之细胞汇合度达到80～90％，然后在无血清培养基中继续培养；

13、(2)收集上清液，离心，除去死细胞；

14、(3)收集上清液继续离心，去除细胞碎片；

15、(4)继续收集上清液，过滤，低温超高速离心，重悬沉淀，再次离心，获得间充质干细胞外泌体。

16、更进一步的，一种含间充质干细胞外泌体的猪纤维蛋白粘合剂：所述的完全培养基为含有1.0～10.0wt％人血小板裂解物、1.0～5.0wt％l-谷氨酰胺以及50～200u硫酸庆大霉素的dmem培养基。

17、更进一步的，一种含间充质干细胞外泌体的猪纤维蛋白粘合剂：所述的间充质干细胞选择p3～p10代间充质干细胞；所述的间充质干细胞选自脐带间充质干细胞、脐血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、牙髓间充质干细胞中的一种。

18、优选的，采用p5代间充质干细胞进行培养。

19、一种含间充质干细胞外泌体的猪纤维蛋白粘合剂的制备方法，该方法包括如下步骤：

20、s1、将所述间充质干细胞外泌体无菌注入到所述猪纤维蛋白原稀释剂中，混合后得到稀释剂a，在所述稀释剂a中溶解所述猪纤维蛋白原，获得猪纤维蛋白原溶液；

21、s2、将所述间充质干细胞外泌体无菌注入进所述猪凝血酶稀释剂中，混合后得到稀释剂b，在所述稀释剂b中溶解所述猪凝血酶，获得猪凝血酶溶液；

22、s3、将所述猪纤维蛋白原溶液与所述猪凝血酶溶液混合，得到所述猪纤维蛋白粘合剂。

23、一种含间充质干细胞外泌体的猪纤维蛋白粘合剂的应用，将所述的猪纤维蛋白粘合剂作为止血材料，用于移植皮肤手术中。

24、本发明的有益效果：

25、(1)本发明制备的猪纤维蛋白粘合剂，可用于整形、烧伤、组织重建等移植皮肤或皮瓣手术中，该猪纤维蛋白粘合剂的成胶时间适中，有利于手术过程中调整皮肤或皮瓣的位置。同时该猪纤维蛋白粘合剂与出血创面接触时，形成凝块状纤维蛋白，黏附在表面，能够减少组织间空腔，也可替代缝合，达到较佳的止血密封效果。

26、(2)本发明的猪纤维蛋白粘合剂中含有间充质干细胞外泌体，其可以抑制炎症发生，促进成纤维细胞活化的胶原蛋白和弹性蛋白的分泌，诱导上皮细胞增殖和血管形成，减少肌成纤维细胞累积和瘢痕形成，同时促进皮肤伤口愈合，从而实现移植皮肤手术中，皮肤或皮瓣粘合的同时增强皮肤组织愈合及修复的目的。

27、(3)与现有的采用局部注射或静脉注射外泌体来促进皮肤损伤修复的方式相比，本发明猪纤维蛋白粘合剂中的外泌体可以以高浓度状态直接且均匀地分布在皮肤创面上，粘合剂在皮肤上黏附，外泌体可以较长时间作用于皮肤创面，相较于单独注射外泌体的方式，更有利于皮肤的愈合及修复。