一种ROS敏感的纳米颗粒及其制备方法和应用

本发明涉及纳米复合材料，特别涉及一种ros敏感的纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术：

1、目前，化疗仍是临床治疗肿瘤的重要手段。然而，药物在杀灭癌细胞的同时杀灭大量的正常细胞，导致治疗效果较差，形成严重的毒副作用。为了克服这些问题，在过去的几十年中，研究人员已经开发了包括脂质体、胶束、纳米凝胶和其他纳米颗粒的各种纳米尺寸的药物递送系统，显著改善了药物的溶解度、稳定性和血液循环时间。基于增强的渗透和保留(epr)效应，这些药物递送系统可以在肿瘤组织处积聚并增加药物浓度。在这些药物递送系统中，具有交联的三维网络的刺激响应性聚合物纳米颗粒作为药物载体已经引起了人们的很多关注，其具有优异的生理稳定性并能够响应细胞内刺激从而在肿瘤部位有效释放药物，例如，ph、活性氧(ros)、谷胱甘肽(gsh)和酶等。ros是最重要的生理刺激之一，其与多种疾病相关，包括癌症、类风湿性关节炎、糖尿病、动脉粥样硬化和阿尔茨海默病。高的ros水平在几乎所有类型的癌症中都很常见，并在癌症的发生和传播中发挥重要作用。此外，ros还参与细胞信号通路，可通过各种途径穿透细胞膜，由于分子氧的不完全还原，细胞内的ros主要由线粒体产生。过氧化氢(h2o2)是细胞中存在的最丰富、最稳定的非自由基ros。正常组织中的h2o2浓度在20nm左右，而癌症组织中的h2o2浓度由于h2o2的产生和积累过多而高达50-100μm。于是研究人员利用这种显著的h2o2浓度差异设计和制备了ros敏感的纳米药物载体，在肿瘤细胞内刺激下，结构发生改变，以达到特定部位高效输送药物的目的。

2、氧化还原反应是过去几十年中最常用的方法之一，并且是实现肿瘤细胞内可控制药物释放的理想选择。二硫键是常用的还原敏感键之一，在血液循环和细胞外环境中足够稳定，但由于细胞外区域和细胞内区域中谷胱甘肽浓度梯度显著，二硫键在细胞内还原环境中裂解产生两个硫醇基团。因此，研究人员已经将二硫键引入载体中制备了许多聚合物纳米颗粒。受二硫键成功的启发，近年来二碲键的材料引起了极大的兴趣，碲元素作为氧族元素中的第四个成员，与硫相比，碲具有更大的原子半径和更低的电负性，使得碲参与形成的化学键键能更低，低价态的含碲分子对氧化刺激更加敏感，由于这些独特的特征，研究人员已经开发出用于生物医学应用的各种碲纳米材料。例如，张乐帅教授课题组合成了含二碲键的两亲性的聚醚氨酯。这些自组装胶束表现出氧化响应性药物的快速释放。殷黎晨教授课题组利用二碲交联的聚乙烯亚胺包裹sivcam-1，在发炎的内皮细胞中，也就是高的ros环境中，其降解成低分子量片段，以促进细胞内sivcam-1释放并增强vcam-1沉默效率。但是，胶束在低浓度下易于解离，稳定性较低。此外，核交联聚合物胶束和纳米凝胶是合成材料，需要复杂的合成步骤，甚至包含光辐射过程。

3、天然多糖，如壳聚糖和透明质酸，是一类多功能的丰富的可再生生物聚合物。由于其具有良好的生物活性、生物相容性和生物降解性，已被广泛应用于生物医学领域，主要应用于口服药物、基因药物、蛋白药物以及疫苗的体内外递送研究中，也可用于制备缓释和靶向制剂，如包载胰岛素、紫杉醇、环孢素、dna和sirna、白细胞介素、5-氟尿嘧啶等。壳聚糖是一种独特的碱性天然多糖，由葡糖胺和n-乙酰氨基葡糖胺构成，壳聚糖提供了多种含有氨基的官能团，可以通过交联来构建水凝胶和纳米颗粒。然而，壳聚糖分子链上的氨基和羟基容易形成强的分子内和分子间氢键，难以在水和多数有机溶剂中溶解，这极大地限制了其应用，因此常常需要对壳聚糖进行化学改性。使用含有氨基的聚合物(如壳聚糖、羧甲基壳聚糖、乙二醇壳聚糖、明胶、牛血清白蛋白、血清白蛋白等)可以克服这一限制，它仍然具有生物降解性、生物兼容性和无毒性的优点，它在药物传递系统中的应用更加广泛，可以制成纳米粒、微球、胶束、智能水凝胶等多种形式。尽管近年来已经使用羧甲基壳聚糖作为原料制备了各种纳米颗粒，但是相应的二碲纳米颗粒很少有报道，可能是因为纳米颗粒的尺寸难以控制。因此，迫切需要开发简单且有效的方法制备二碲交联的天然高分子基纳米颗粒。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供一种ros敏感的纳米颗粒的制备方法，该制备方法工艺简单，通过将3,3'-二碲二丙酸二(n-羟基丁二酰亚胺酯)与含有氨基的聚合物的交联反应制备得到的纳米颗粒，ros敏感性强，且生物相容性和生理稳定性良好。

2、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明提供一种ros敏感的纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

4、s1：合成二碲二丙酸；

5、s2：制备二碲交联的纳米颗粒：在氮气环境中，将二碲二丙酸和n-羟基琥珀酰亚胺溶于二氯甲烷中，然后在冰浴中，将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的二氯甲烷溶液滴加到混合溶液中，并在室温下搅拌混合物4h；加入水经过萃取、蒸发，得到黄色固体，即3,3'-二碲二丙酸二(n-羟基丁二酰亚胺酯)；将其溶于丙酮中，即得二碲二丙酸活性酯溶液；将二碲二丙酸活性酯溶液缓慢加入含有氨基的聚合物的水溶液中，在室温下搅拌3h后离心收集纳米颗粒，即得。

6、相比于现有技术，本发明采用简单的方法步骤首次制备得到二碲交联的纳米颗粒，通过3,3'-二碲二丙酸二(n-羟基丁二酰亚胺酯)(dsedpa-nhs)与含有氨基的聚合物的交联反应即可制得纳米颗粒，方法步骤简单，且不需要任何催化剂和乳化剂。采用该制备方法制得的二碲交联的纳米颗粒中的二碲键可以在高氧化还原和ros水平的环境下，发生纳米颗粒的解离，在作为药物载体时有利于药物的快速释放。选择含有氨基的聚合物作为纳米颗粒的骨架，不仅提高了纳米载体的生物相容性，而且增强了生理稳定性。可见，该方法具有明显的成本效益和操作便利性，可促进高分子的二碲纳米材料的发展。

7、进一步地，步骤s1中，采用以下方法合成二碲二丙酸：在氮气环境中，将碲粉悬浮在水中，然后将硼氢化钠的水溶液逐渐加入碲粉悬浮液中；当溶液澄清后，加入碲粉并在100℃下搅拌30min；然后，将3-氯丙酸的水溶液加入到混合溶液中，并在室温下搅拌反应24h，过滤除去沉淀物，将溶液酸化后收集得到黄色沉淀物，并在乙酸乙酯中重结晶。

8、进一步地，步骤s2中，所述二碲二丙酸活性酯溶液中3,3'-二碲二丙酸二(n-羟基丁二酰亚胺酯)的浓度为6～9mg/ml。

9、进一步地，步骤s2中，所述二碲二丙酸、n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的摩尔比为2:5:5。

10、进一步地，步骤s2中，步骤s2中，所述含有氨基的聚合物为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、乙二醇壳聚糖、明胶、牛血清白蛋白或人血清白蛋白中的任一种。这些聚合物含有氨基，氨基可以与3,3'-二碲二丙酸二(n-羟基丁二酰亚胺酯)反应从而交联成纳米颗粒。

11、优选的的，步骤s2中，所述含有氨基的聚合物为羧甲基壳聚糖，羧甲基壳聚糖水溶液的浓度为10～25mg/ml。

12、进一步地，步骤s2中，离心转数为10000～12000rpm，离心时间为10min。

13、进一步地，步骤s1中，所述碲粉悬浮液中的碲粉与所述硼氢化钠的水溶液中的硼氢化钠的摩尔比为1:2；当溶液澄清后加入的碲粉和所述3-氯丙酸的水溶液中的3-氯丙酸的摩尔比为1:2。

14、本发明还提供采用上述制备方法制备得到的ros敏感的纳米颗粒。

15、本发明还提供上述ros敏感的纳米颗粒在作为药物载体时的应用。尤其是作为化疗药物的载药材料时，二碲键可以在高氧化还原和ros水平的环境下，发生纳米颗粒的解离，伴随着化疗药物的快速释放。

16、本发明还提供一种载阿霉素纳米颗粒，其采用上述ros敏感的纳米颗粒作为阿霉素的载体。优选的，该载阿霉素纳米颗粒可以采用以下方法制得：将阿霉素溶液加入到ros敏感的纳米颗粒的悬浮液中，在室温下暗处搅拌12h后，将悬浮液以1×104rpm离心10分钟，之后将沉淀真空干燥，即得载阿霉素纳米颗粒。

17、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

18、(1)本发明通过简单的方法步骤制得二碲交联的纳米颗粒，纳米颗粒中的二碲键可以在高氧化还原和ros水平的环境下，发生纳米颗粒的解离，在作为药物载体时有利于药物的快速释放。同时，其生物相容性和生理稳定性强，有利于其在作为化疗药物载体时的应用。

19、(2)本发明的制备方法不需要任何催化剂和乳化剂，其成本低廉且操作方便，具备良好的经济效益和大规模生产前景，这将促进高分子的二碲纳米材料的发展。

20、(3)经过实验可以验证，作为阿霉素的载体时，本发明提供的二碲交联的纳米载体ros敏感强，不仅提高了生理稳定性，而且能有效抑制dox的释放。