用于预防或治疗仔猪流行性腹泻的药物制剂及其制备方法

本发明涉及一种用于预防仔猪流行性腹泻的药物制剂及其制备方法，属于生物防控，用于阻断ped病毒的入侵，增强新生仔猪肠道黏膜免疫屏障，降低仔猪ped发病率。

背景技术：

1、猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，ped)由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemic diarrhea virus,pedv)引起的感染仔猪以呕吐、水样腹泻、急性脱水和食欲降低为主要症状的高度接触传染性消化道疾病。哺乳仔猪，尤其是新生仔猪，ped发病率高达90％，病死率可达100％。由于ped具有传播迅速、致死率高等特点。

2、尽管市场上已有ped疫苗，但pedv变异较快，现有pedv毒株的疫苗不能及时控制pedv新毒株的感染。寻找其它预防ped的方法已迫在眉睫。pedv主要感染哺乳仔猪，尤其新生仔猪。随着日龄的增加哺乳仔猪的死亡率显著降低。所以，1-7日龄是哺乳仔猪感染pedv的易感窗口期，在这个时期阻止或减少pedv的入侵就能避免pedv的感染或降低新生仔猪的死亡。pedv主要感染新生仔猪小肠黏膜的肠上皮细胞。如果能阻止病毒入侵肠上皮细胞就能预防pedv的感染。小肠黏膜上皮外覆盖有一层黏液，黏液、黏膜上皮中的上皮内淋巴细胞以及黏膜下分布的cd3+t细胞均具有较强抵抗pedv的功能。小肠黏膜处分布大量的iga+细胞，能够抑制pedv在肠上皮的粘附，也具有中和病毒的能力。肠道内杯状细胞分泌的黏液具有抗病毒作用，可以显著抑制pedv的入侵。如果能促进杯状细胞黏液的分泌，增加小肠黏膜中上皮内淋巴细胞以及黏膜下分布的cd3+t细胞和iga+细胞的数量就能加强小肠的黏膜屏障，抵抗pedv的入侵。

3、新生仔猪肠道免疫系统发育不完善，杯状细胞数量较少，cd3+t细胞和iga+细胞的数量也很少，尤其在1-7日龄是哺乳仔猪感染pedv的高峰期，通过应用疫苗不能及时产生肠道黏膜免疫力。

4、转铁蛋白受体1(tfr1)是pedv的重要协同受体，铁含量可显著影响tfr1的表达，仔猪缺铁引起的肠绒毛上皮细胞高水平表达的tfr1可能是新生仔猪更易感染pedv的原因和机制。但是对于新生仔猪更易感染pedv的具体原因和机制尚不清楚，直接通过补充铁剂或补充何种形式的铁剂能不能解决该问题也有待进一步研究。

5、酸化剂作为无毒、无污染、无抗性的功能性饲料添加剂，在提高免疫力、促进肠道健康和动物生长方面发挥了重要作用。日粮中添加酸化剂可降低胃肠道的ph值，调节和改善肠道微生物群并抑制对低ph敏感的有害微生物的活性；酸化剂可提高仔猪胃蛋白酶活性，促进胃肠道营养物质的消化吸收。酸化剂的种类有很多，对于哪些酸化剂能够具体有效，还有待进一步研究。

6、钙离子作为一种重要的阳离子，在免疫系统的不同细胞中作为第二信使，参与免疫细胞之间的信号传递，在免疫调节中发挥重要作用。提高细胞内钙离子的浓度可以显著增强细胞毒性t淋巴细胞和自然杀伤细胞的功能。研究发现猪小肠黏液中钙蛋白酶-1具有较强抵抗pedv的功能。钙蛋白酶是一种受钙离子调节的半胱氨酸蛋白酶，适当补充钙离子能够激活钙蛋白酶发挥抗病毒作用。钙离子的种类很多，添加有何种钙能够激活蛋白酶发挥作用，尚不清楚。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的第一个目的是提供了预防或治疗仔猪pedv感染的药物制剂。

2、本发明第二个目的是提供了一种简便、安全、廉价用于预防或治疗仔猪pedv感染的口服液，用于提高增强新生仔猪肠道的黏膜屏障，抵抗pedv的入侵。

3、本发明的第三个目的是提供了预防或治疗仔猪pedv感染的药物制剂或口服液的制备方法。

4、本发明的第四个目的是提供了以上的药物制剂或口服液在治疗预防或治疗仔猪流行性腹泻中的应用。

5、技术方案：本发明提供了用于预防或治疗仔猪流行性腹泻的药物制剂，包括如下组分制成：柠檬酸5～100mg、苯甲酸5～100mg、乙酸钙2～80mg和硫酸亚铁5～80mg，ph为3.0。

6、其中，所述药物制剂的剂型包括口服液、混悬剂、溶液剂或散剂中的一种。

7、本发明的口服液命名为酸铁宝宝。

8、本发明还提供了一种用于预防或治疗仔猪流行性腹泻的口服液，包括如下组分制成：柠檬酸5～100mg、苯甲酸5～100mg、乙酸钙2～80mg、硫酸亚铁5～80mg和pbs缓冲液或饮用水，ph为3.0。

9、本发明还提供了所述的一种用于预防或治疗仔猪流行性腹泻的药物制剂的制备方法，包括以下步骤：称量柠檬酸5～100mg、苯甲酸5～100mg、乙酸钙2～80mg、硫酸亚铁5～80mg，均匀混合后使用研钵碾为细小颗粒。

10、本发明还提供了所述的用于预防或治疗仔猪流行性腹泻的口服液的制备方法，包括以下步骤：称量柠檬酸5～100mg、苯甲酸5～100mg、乙酸钙2～80mg、硫酸亚铁5～80mg，均匀混合后使用研钵碾为细小颗粒，使用时溶于5～20ml pbs缓冲液或饮用水中。

11、本发明还提供了所述的药物制剂或所述的口服液在制备由pedv病毒引起的疾病的药物中的应用。

12、其中，所述药物的剂量为3～5ml/kg动物。

13、具体的，本发明为了评估不同酸化剂对仔猪肠道免疫的调节作用，通过肠结扎试验验证，结果显示仔猪空肠处注射苯甲酸(ph为3.5，酸性)，柠檬酸(ph为6.96，中性)时能显著提升仔猪肠道il-6的mrna表达水平，因此选用苯甲酸和柠檬酸作为酸化剂进行后续动物饲喂实验。

14、具体的，本发明为了评估酸铁宝宝对新生仔猪的保护作用，通过口服方式进行pedv攻毒(1ml 1×107pfu/ml)，结果显示口服酸铁宝宝能够显著缓解仔猪的临床症状。

15、具体的，为了评估口服酸铁宝宝对仔猪肠道tfr1蛋白的影响，通过western blot试验进行验证。结果显示口服酸铁宝宝能够极显著降低肠道tfr1相对蛋白含量(p<0.01)，降低肠道pedv入侵协同受体tfr1的表达，从而减少pedv的感染。

16、具体的，为了评估口服酸铁宝宝后对仔猪肠道pedv入侵和载量的影响，本发明进行了qpcr、western blot和免疫组化试验。结果显示口服酸铁宝宝能极显著降低十二指肠，空肠和回肠pedv mrna的相对表达量(p<0.01,p<0.01,p<0.01)；显著降低十二指肠空肠和回肠pedv的蛋白相对含量(p<0.01,p<0.05,p<0.05)，降低pedv在空肠和回肠绒毛顶端的载量。综上所述，仔猪口服酸铁宝宝能减少pedv的入侵并降低pedv的载量。

17、具体的，为了评估口服酸铁宝宝对仔猪肠道cd3+t细胞、iga+细胞和杯状细胞数量，黏蛋白和钙蛋白酶-1含量的影响，本发明进行了免疫组化、免疫荧光以及pas染色试验。结果显示攻毒pedv后新生仔猪十二指肠、空肠和回肠cd3+t淋巴细胞数量极显著下降(p<0.01,p<0.01,p<0.01)，而仔猪口服酸铁宝宝后极显著提高了仔猪空肠和回肠的cd3+t细胞数量(p<0.01,p<0.01)；极显著提高了仔猪回肠iga+细胞数量(p<0.01)；口服酸酸铁宝宝后仔猪十二指肠杯状细胞数量极显著增加，高于pedv攻毒仔猪和空白仔猪(p<0.01,p<0.01)，空肠和回肠的杯状细胞数量极显著高于pedv攻毒仔猪(p<0.01,p<0.01)；极显著提高了muc2的蛋白含量(p<0.01)；极显著提高了肠道钙蛋白酶-1蛋白含量(p<0.01)。上述结果表明仔猪口服酸铁宝宝能提高cd3+t细胞、iga+细胞和杯状细胞的数量，提高仔猪肠道muc2和钙蛋白-1的蛋白含量，从而改善肠道先天性黏膜屏障，提高仔猪抵抗pedv的能力。

18、具体的，口服酸铁宝宝能够降低仔猪腹泻评分，改善因pedv攻毒造成的仔猪体重下降，对仔猪有较好的保护作用。

19、本发明的机理：针对现有疫苗不能及时产生肠道黏膜免疫力，本发明通过硫酸亚铁来降低仔猪肠道tfr1的表达降低pedv感染，同时，柠檬酸和苯甲酸能够适度改善仔猪的免疫功能，提高仔猪的抗氧化能力以及生长性能，从而降低仔猪的腹泻率，乙酸钙的加入可以进一步通过增加黏液及钙蛋白酶-1的分泌进一步抵抗pedv的感染。本发明同时应用硫酸亚铁、柠檬酸和苯甲酸以及乙酸钙，通过阻断pedv的入侵，增强新生仔猪肠道黏膜免疫屏障，大大降低仔猪ped的发病率。

20、有益效果：与现有技术相比，本发明一方面降低了tfr1受体的表达，减少了pedv的入侵，极大降低了ped病毒在仔猪肠道中的复制以及ped病毒的含量，缓解了因ped病毒导致的仔猪腹泻症状。另一方面增加了仔猪肠道中免疫活性细胞如cd3+t细胞、iga+细胞和杯状细胞的数量，提高了muc2和钙蛋白酶-1的含量，提高了仔猪的肠道免疫力，增强了肠道屏障功能。此外，本发明还可促进仔猪的生长，增加仔猪的体重。综上所述，酸铁宝宝有望开发为预防仔猪流行性腹泻的保护剂(非疫苗)，通过提高新生仔猪肠道的先天性免疫，降低ped病毒受体的表达，阻断病毒的入侵，显著降低仔ped的发病率。综上，本发明首次通过非疫苗的策略预防病毒从黏膜处的感染，并具有安全性好，效率高、价格低等特点。