一种联合干细胞和水凝胶的生物材料及其制备方法和应用与流程

本发明涉及水凝胶，具体涉及一种联合干细胞和水凝胶的生物材料及其制备方法和应用。

背景技术：

1、消瘦的老年患者常因长时间瘫痪卧床而出现压疮，压疮的出现通常是由于长期缺乏脂肪组织保护的压力所致。臀部压疮在患者中更为常见。压疮不仅给患者带来了沉重的经济负担，而且加剧了他们的身体疼痛，甚至引起了危及生命的并发症。随着人口老龄化，压疮的发病率逐年增加。压疮的有效治疗方式是目前尚待解决的难题。目前，较传统的治疗方法是在术后固定并用纱布和棉垫包扎。但是，术后护理的不便之处不容忽视。压疮需要患者每2小时翻身一次。但是，手术部位和周围组织之间的相对运动会导致绷带松动，失去固定并影响伤口愈合。因此，制备具有高机械性能和良好生物相容性的伤口敷料仍然是压疮伤口的迫切临床需求。

2、压疮是一种慢性伤口，仅使用单一材料来治疗慢性伤口是不够的。先前的研究报道伤口愈合可以分为四个阶段：止血，炎症，增殖和重塑。在伤口愈合的增殖和重塑阶段，血管化尤其重要，因为血管在伤口愈合的过程中提供了充足的养分，加速了代谢废物的交换，并增强了细胞的黏附，迁移和存活率。据报道，脂肪干细胞(adscs)可以通过增加血管密度来促进组织修复。负载水凝胶的adscs可以促进受损组织中血管内皮生长因子(vegf)和其他细胞因子的释放。细胞因子影响巨噬细胞和内皮祖细胞的增殖和分化，可以促进神经和胶原的再生。

3、皮肤分为表皮、真皮及皮下组织3层，皮下组织中的脂肪不但可以保护上层的细胞，提供缓冲作用，还可以提供间充质干细胞。脂肪间充质干细胞来自中胚层，可以分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等多种细胞类型，经过体外扩增可治疗自身免疫性疾病、银屑病、骨关节炎、肛瘘、肌萎缩侧索硬化症等多种疾病。

4、中国专利cn105300848b的发明专利，公开了一种脂质体人工皮肤膜，其主要成分为卵磷脂，制备过程包括脂质体制备、多孔膜与嵌套底部密封、脂质体与多孔膜结合、冻融循环等步骤。

5、中国专利cn114470338b的发明专利，公开了一种真皮层、人工皮肤及其制备方法。其真皮层的原料包括：重组人源胶原蛋白、维替泊芬和酶，其原料中维替泊芬提供了有效的机械转导机制，调节伤口愈合过程中的en1的表达，诱导正常真皮超微结构的恢复，解决了皮肤愈合过程中疤痕产生，无法生成毛囊、皮脂腺和其他真皮附属物的问题。

6、中国专利申请cn113797388a的发明专利，公开了一种甲壳素人工皮肤膜及制备方法，通过利用低温冻融法，以甲壳素粉末为原料，研究氢氧化钠浓度、甲壳素用量、尿素浓度等对膜材料形成的影响，研究复合材料种类、配比等对对复合材料膜力学性能的影响，优化制备条件，制备出具有适宜强度、降解率和力学性能的多功能膜材料。

7、中国专利cn113577398b的发明专利，公开一种3d打印人工皮肤及其制备方法，其皮肤包括：表皮层和真皮层；表皮层覆设于真皮层的上表面，呈水凝胶状态，具有ph敏感性；表皮层的组分包括：第一明胶、单宁酸和铁盐，改善了表皮层的力学性能，具有长效稳定的抗菌和抗炎特性；解决了现有技术中表皮层的抗菌物质爆发性释放对正常细胞造成细胞毒性的问题。

8、但是以上相关专利存在如下问题：所采用的脂质等材料成本较高；制备过程较为复杂；制得的人工皮肤效果不佳；未用于活性物质渗透预测研究；脂质仿生屏障permeapadtm更适宜模拟体内吸收的过程。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提出一种联合干细胞和水凝胶的生物材料及其制备方法和应用，不仅具有很好的生物降解性、机械性能以及生物相容性，具有细胞低毒性，溶解性佳，保湿性、稳定性好，黏度低，能够促进脂肪干细胞的增殖和发挥效果，能够明显促进创面愈合，抗菌抑菌，消炎，细胞增殖，促进血管生成，胶原蛋白的生长，从而促进皮肤新生，具有广阔的应用前景。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、本发明提供一种联合干细胞和水凝胶的生物材料的制备方法，从脂肪中获得细胞并诱导分化获得脂肪干细胞培养液，加入经过没食子酸、精氨酸、酪氨酸改性并且季铵化改性的改性壳聚糖，低频超声波处理，交联倒入模具，室温放置，获得联合干细胞和水凝胶的生物材料。

4、作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：

5、s1.诱导分化培养基的制备：配制含有胎牛血清、青霉素、链霉素、成纤细胞生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、血小板衍生因子bb、维生素、胰岛素、胆固醇和白介素组合物的dmem培养基培养基；

6、s2.脂肪干细胞的培养：取脂肪绞碎，洗涤，加入i型胶原酶/pbs消化液中处理，过滤，滤过液离心，用pbs缓冲液重悬，加入dmem培养基中，培养，传代，取第4-5代细胞，加入步骤s1制得诱导分化培养基进行诱导分化；

7、s3.获得脂肪干细胞：将第5-6代稳定增殖的脂肪干细胞待细胞贴壁生长融合率达到70％-80％时，离心，去除沉淀，滤液过滤除菌，获得脂肪干细胞培养液；

8、s4.没食子酸改性壳聚糖的制备：将壳聚糖溶于酸液中，加入没食子酸，搅拌混合均匀，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺，调节溶液ph值为5-5.5，搅拌反应，透析，过滤，冷冻干燥，制得没食子酸改性壳聚糖；

9、s5.复合氨基酸/没食子酸改性壳聚糖的制备：将精氨酸和酪氨酸混合溶于吗啉乙磺酸缓冲液中，加入n-羟基丁二酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，调节溶液ph值为5.5-6，搅拌活化，加入步骤s4制得的没食子酸改性壳聚糖，搅拌反应，透析，过滤，冷冻干燥，制得复合氨基酸/没食子酸改性壳聚糖；

10、s6.壳聚糖的季铵化：将步骤s5制得的复合氨基酸/没食子酸改性壳聚糖加入n-甲基吡咯烷酮中，加入nai和碱，加热搅拌反应，加入碘甲烷，继续反应，透析，过滤，冷冻干燥，制得改性壳聚糖；

11、s7.联合干细胞和水凝胶的生物材料的制备：将步骤s6制得的改性壳聚糖加入步骤s3获得的脂肪干细胞培养液中，低频超声波处理，培养3-5d，加入戊二醛和酪氨酸酶交联，搅拌混合均匀，倒入模具，室温放置，获得联合干细胞和水凝胶的生物材料。

12、作为本发明的进一步改进，步骤s1中所述培养基含有10-12wt％胎牛血清、80-120u/ml的青霉素、80-120u/ml的链霉素、1-3μg/ml成纤细胞生长因子、1-3μg/ml表皮生长因子、1-3μg/ml血管内皮生长因子、1-3μg/ml血小板衍生因子bb、0.2-0.4mg/ml维生素、3-5μg/ml胰岛素、5-10μg/ml胆固醇和500-1000iu/ml白介素组合物的dmem培养基；所述维生素为维生素b1和维生素c的混合物，质量比为3-5:7，所述白介素组合物为il-6和il-3的混合物，质量比为7-10:3-5。

13、作为本发明的进一步改进，步骤s2中所述i型胶原酶/pbs消化液中i型胶原酶的浓度为0.3-0.5wt％，ph值为6.5-6.7，所述处理的温度为35-37℃，时间为20-30min，所述pbs缓冲液的ph值为6.5-6.7，加入dmem培养基至细胞浓度为109-1010个/l，所述培养的条件为36-38℃，4-7v/v％co2含量，100-120r/min培养，加入步骤s1制得诱导分化培养基至细胞浓度为108-109个/l；步骤s3中所述离心条件为3000-5000r/min，时间为20-30min，所述过滤的滤膜孔径为0.22μm。

14、作为本发明的进一步改进，步骤s4中所述酸液为2-4wt％的醋酸或盐酸溶液，所述壳聚糖、没食子酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺的质量比为16-18:4-5:3-4:2-3，所述搅拌反应的温度为室温，时间为20-24h，所述透析的透析膜孔径为3-5kda，时间为5-7h。

15、作为本发明的进一步改进，步骤s5中所述精氨酸、酪氨酸、n-羟基丁二酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、没食子酸改性壳聚糖的质量比为4-5:1-2:6-7:4-5:19-20，所述搅拌活化的时间为1-3h，所述搅拌反应的温度为室温，时间为16-20h，所述透析的透析膜孔径为3-5kda，时间为3-5h。

16、作为本发明的进一步改进，步骤s6中所述复合氨基酸/没食子酸改性壳聚糖、nai、碱、碘甲烷10：15-17：10-12：10-12，所述加热搅拌反应的温度为55-60℃，时间为15-20min，所述继续反应的时间为1-3h，所述透析的透析膜孔径为3-5kda，时间为3-5h。

17、作为本发明的进一步改进，步骤s7中所述改性壳聚糖、脂肪干细胞培养液、戊二醛和酪氨酸酶的质量比为25-32:100:2-3:1-2，所述低频超声波处理的条件为70-150w超声波，所述室温放置的时间为2-4h。

18、本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的联合干细胞和水凝胶的生物材料。

19、本发明进一步保护一种上述的联合干细胞和水凝胶的生物材料在制备压疮药物、烫伤药物、皮肤修复药物中的应用。

20、本发明具有如下有益效果：

21、本发明制备了一种能够适合并明显促进脂肪干细胞生长、分化的培养基，其中，白介素il-3的主要作用为促进脂肪干细胞的定向分化与增殖，调节多种成熟细胞的生长、分化及相关的基因表达，包括c-myc、il-2ra基因等。白介素il-6能够促进脂肪干细胞分泌生长因子，促进血管生成、细胞的增殖分化、炎症反应以及趋化性的功能，两者的添加具有协同增效的作用。维生素是细胞生长和分化所必需的物质，本发明添加的维生素b1和维生素c能够明显促进脂肪干细胞的代谢和增殖。胰岛素能够促进脂肪干细胞的增殖和分化。胆固醇是细胞膜的组成成分，可维持细胞膜的完整性和稳定性。成纤细胞生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、血小板衍生因子bb等，生长因子能够与细胞表面的受体结合，促进细胞的增殖和分化，有助于维持细胞的生长状态。抗生素，包括青霉素和链霉素，可以预防细菌和真菌的污染，保护细胞免受外界微生物的侵袭。

22、本发明将壳聚糖大分子链上有很多羟基、氨基等活性基团与没食子酸、复合氨基酸反应，进一步进行季铵化反应改性，一方面使得制得的改性壳聚糖具有很好的溶解性，扩大其应用范围；另一方面，季铵化壳聚糖的细胞毒性降低并提高了其抗菌活性，提高了原位成胶和组织黏附性能，可以快速填充任意形状的伤口，并与伤口轮廓进行黏合；没食子酸改性使得壳聚糖分子链上连接上了没食子酸分子结构，使得制得的改性壳聚糖的抗菌作用增强，可诱导大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的生物被膜特性发生不可逆变化和破坏，增强细菌外膜和内膜的通透性，从而破坏细菌细胞膜的通透性和完整性。精氨酸和酪氨酸改性使得制得的改性壳聚糖的创面愈合、抗炎、促进细胞增殖效果明显提高，精氨酸在体内能被一氧化氮合酶和精氨酸酶催化生成no和鸟氨酸，在创面愈合过程中影响血管生成、炎症、细胞增殖基质沉积和重塑等方面有着显著的效果；鸟氨酸是脯氨酸的前体，脯氨酸则可作为胶原蛋白合成的底物，同时，精氨酸也是合成尿素、肌酸和多胺(如精胺和腐胺)的前体，肌酸能辅助肌肉合成和能量的供给，对促进创面愈合有积极作用。酪氨酸能够给皮肤提供丰富的营养，避免皮肤出现溃烂，并且调节皮肤肤色。另外，也可以通过酪氨酸酶和戊二醛的联合使用促进改性壳聚糖的交联，从而得到性能很好的水凝胶材料。

23、本发明通过没食子酸、复合氨基酸和季铵化改性壳聚糖，不仅保持了壳聚糖本身具有很好的保湿、抗菌和生物相容性的作用，还能够提高改性壳聚糖的溶解性，降低黏度，提高力学性能，并且能够明显促进创面愈合，抗菌抑菌，消炎，细胞增殖，促进血管生成，胶原蛋白的生长，从而促进皮肤新生。

24、本发明使用的低频超声波培养为脂肪干细胞提供了良好的外部环境和能量，从而能够大大促进脂肪干细胞的增殖。

25、本发明联合干细胞和水凝胶的生物材料不仅具有很好的生物降解性、机械性能以及生物相容性，具有细胞低毒性，溶解性佳，保湿性、稳定性好，黏度低，能够促进脂肪干细胞的增殖和发挥效果，能够明显促进创面愈合，抗菌抑菌，消炎，细胞增殖，促进血管生成，胶原蛋白的生长，从而促进皮肤新生，具有广阔的应用前景。