一种具有稳定成骨活性的多孔电纺丝骨膜材料及其制备方法

本发明实施例涉及生物医学工程，具体涉及一种具有稳定成骨活性的多孔电纺丝骨膜材料及其制备方法。

背景技术：

1、运动系统中，骨折是最常见的损伤类型之一。一方面成体后的骨修复再生过程被认为是重复了骨发育中的软骨内成骨和膜内成骨，而且骨痂组织和胚胎发育中的骨组织有转录组相似性；另一方面，骨折或骨缺损等创伤引发的骨再生又伴随着剧烈的炎症反应和复杂多变的免疫细胞与骨系细胞的相互作用和调控。虽然骨折修复过程中的干预和治疗手段近年来得到明显改善，但是骨折中仍有部分损伤存在损伤延迟甚至骨不连的情况。因此，对骨损伤修复过程更细致的研究对于优化骨损伤的修复速率和质量十分重要，也是迫切需求。

2、骨缺损修复的常见治疗方法包括自体骨移植和同种异体骨移植，然而这些治疗方法在骨的修复和再生中都存在不少局限。自体骨移植的骨组织具有良好的组织相容性和非免疫原性，然而，自体骨移植存在一定的缺点，比如出血、炎症、感染和慢性疼痛，以及供体部位损伤和畸形、过敏、瘢痕等；此外，自体骨移植的来源有限，不能处理大面积的骨缺损。异体骨移植是治疗骨缺损的另一常见治疗选择，但也有缺乏供体、病毒性疾病传播、细菌感染或免疫排斥等风险。同时在骨损伤时，局部细胞的成骨分化对于有效的骨修复至关重要。现阶段众所周知的骨缺损治疗方法往往侧重于促进外源性或内源性mscs/祖细胞的趋化募集与成骨分化，往往忽视了植入支架的特性对局部骨组织修复的效果。

3、骨缺损与骨不连的修复是骨科临床实践中需要解决的关键问题。目前，还没有一种单独的生物材料具有理想的性能来有效地模拟骨组织。因此，目前的研究主要集中在复合材料的开发、分子和细胞的功能化、新型支架的建立等方面。

技术实现思路

1、本发明是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识做出的：

2、bmp(骨形态发生蛋白)通过控制成骨细胞和破骨细胞的分化来调节骨平衡，是促进成骨的关键因素。bmp的生物学功能是通过细胞不同的信号通路调节生长发育。bmp信号通路是通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体转导，即i型受体(bmpr-i)和ii型受体(bmpr-ii)。这两种受体结合成一种复合物，启动进一步的信号转导。其载体应具有良好的力学性能、生物相容性、耐腐蚀性、耐磨性和良好的骨结合能力等特性。目前，许多复合bmp的生物材料已用于治疗骨科疾病，并取得了预期的效果。其中，骨形态发生蛋白-2(bmp-2)是bmp家族成员中作用最强的因子，可促进alp表达以增加成骨细胞矿化，也可通过调控骨代谢以抑制骨吸收和促进骨形成。体外采用bmp-2直接或通过其他载体局部应用可促进骨形成已得到实验验证，但通过物理方式运载bmp-2到骨缺损部位，因bmp-2在体内容易扩散或降解，导致无法充分发挥其功能。

3、静电纺丝技术是一种能够直接、连续制备聚合物纳米纤维的方法，这种方法依靠表面电荷之间的静电斥力不断地从黏弹性流体中产生纳米纤维。静电纺丝法制备的纤维膜质地柔软，生物相容性好，可减少植入后的不适。静电纺丝技术是目前制备微纳米纤维最简单实用的方法之一，可以通过控制自身参数(如纺丝电压、纺丝距离、喷速等)和纺丝液的浓度等制备不同直径的微纳米纤维膜，从而控制纤维的表面粗糙度，最主要的是静电纺丝技术制备出来的膜片具有优异的比表面积，利于更多的细胞进行黏附生长。同时，静电纺制作纳米纤维具有成本低、易于操作等优势，因而被应用于疏水吸油材料的制备。

4、pcl(聚己内酯)：常用的静电纺丝聚合物，由于其为半结晶聚合物、熔点低的特性使pcl可在低温下成型，且成型后延展性好。同时自身具有良好的力学性能、生物降解性以及生物相容性，已被广泛应用于医疗、组织工程和材料等领域。

5、pda(聚多巴胺)是一种受贻贝中粘附蛋白启发的合成聚合物，在弱碱性环境中通过michael加成或schiff碱反应几乎可以在任何材料表面形成具有黏附特性的功能化涂层，并不依赖基体的形状和结构。此外，pda还具有抗菌性能，已经作为独立或复合抗菌材料被广泛研究。

6、组织工程的顺利实施及应用需要具有以下3个方面的条件：①合适的种子细胞；②支持细胞黏附和生长的支架材料；③诱导、调控组织增殖分化的生物活性因子。为此，本发明以pcl、pda及bmp-2为原料，结合静电纺丝技术制备一种具有稳定成骨活性的多孔电纺丝骨膜材料，该材料疏松多孔利于细胞黏附生长，pda发挥双面胶的功能，大大降低bmp-2自动释放的速率及可能性，为细胞提供广泛比表面积，可促进细胞黏附生长并能促进细胞成骨分化，另外该材料柔韧性强，可承受手术和组织生长过程中产生的应力，满足临床的使用要求，以解决骨缺损骨移植后移植物难以存活、愈合、愈合缓慢等问题。

7、为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

8、根据本发明实施例的第一方面，本发明提供一种具有稳定成骨活性的多孔电纺丝骨膜材料的制备方法，所述方法包括：

9、制备pcl电纺丝薄膜；

10、在所述pcl电纺丝薄膜的表面沉积pda，得到经pda表面改性的pcl电纺丝薄膜；

11、在所述经pda表面改性的pcl电纺丝薄膜的表面沉积bmp-2，之后经灭菌，制得所述多孔电纺丝骨膜材料。

12、进一步地，所述pcl电纺丝薄膜的制备方法如下：以体积比为1∶1的乙酸和甲酸为溶剂，将pcl配制成质量分数为12-17％的pcl纺丝液，进行静电纺丝，得到所述pcl电纺丝薄膜。

13、进一步地，所述静电纺丝的条件如下：pcl纺丝液的流速为0.3-0.4ml/h，针头与接收装置之间电压为13-15kv，接收距离为14-15cm。

14、进一步地，使用第一沉积液进行沉积pda的步骤，所述第一沉积液含有1mg/ml多巴胺和20mm 2-哌啶乙醇，且以体积比为3∶7的无水乙醇和超纯水的混合液为溶剂。

15、进一步地，所述沉积pda的步骤包括：将pcl电纺丝薄膜浸泡于第一沉积液中，37℃孵育24h后翻转，37℃再次孵育24h，去离子水清洗3次，37℃烘干24h。

16、进一步地，使用第二沉积液进行沉积bmp-2的步骤，所述第二沉积液为浓度600μg/ml的bmp2水溶液。

17、进一步地，所述沉积bmp-2的步骤包括：将经pda表面改性的pcl电纺丝薄膜浸泡于第二沉积液中，4℃孵育8h后翻转，4℃过夜，在-75～-80℃条件下冻干。

18、进一步地，所述bmp-2的氨基酸序列为：

19、dssdssdssdssdssdssc5h8no3s。

20、进一步地，所述灭菌采用60co-γ射线进行辐照，辐照剂量为25-35kgy。

21、根据本发明实施例的第二方面，本发明提供一种具有稳定成骨活性的多孔电纺丝骨膜材料，其由如上任一项所述的方法制成。

22、本发明实施例具有如下优点：

23、1、本发明通过将pla、pda及bmp-2进行联合使用制备仿生骨膜，在极大程度避免免疫源性反应发生的同时，使得具有疏松多孔且亲水性提高的电纺丝薄膜结构与强生物活性的bmp-2结合，分别从促进干细胞黏附与增殖、促进局部细胞成骨分化的不同方面对骨缺损区域进行快速修复。

24、2、本发明充分利用了电纺丝疏松多孔利于细胞黏附增殖的特殊结构，并利用pda对电纺丝进行表面改性，使pcl电纺丝薄膜亲水性显著增强，同时pda发挥双面胶作用，稳定而牢固的黏附成骨蛋白bmp-2，从而避免了外源性细胞与组织运用可能带来的不必要麻烦与问题，从而实现了加速骨缺损修复的目的。

25、3、本发明所用的pla电纺丝制备浓度与pda浓度、bmp-2的浓度均在合适且可控的浓度范围内，三者的联合使用均在保护范围内，不会在成骨过程中对组织产生毒副作用及不良反应。

26、4、经过体外材料学实验观察膜片的外观、理化性质，用细胞实验评价分别含有pda和bmp-2的材料对bmscs的促进增殖和促成骨作用效果和机制，通过裸鼠体内的骨诱导活性实验评价该材料骨诱导活性的干预效果及规律。在明确的bmp-2促进成骨分化的机制作用下，尽可能显著提高骨修复材料在骨组织修复中的成骨效率。最重要的是制备出一种具有高效成骨活性的理想骨膜材料，实现加速骨缺损区域骨愈合的目的，同时最大可能地发挥多孔柔软电纺丝结构及多巴胺修饰的优势，与具有高活性促成骨的成骨蛋白bmp-2的协同作用下达到协同成骨的目的。