一种预防及控制糖尿病的益生菌组合物及其制备方法与流程

本发明涉及益生菌，具体涉及一种预防及控制糖尿病的益生菌组合物及其制备方法。

背景技术：

1、糖尿病已经成为世界上继肿瘤、心脑血管病之后第三位严重威胁人健康的慢性病。同时，它将严重影响人的心脑血管和肾脏。在患有糖尿病的人群中，90％以上是2型糖尿病。2型糖尿病是由于血糖自平衡失调而表现高血糖症状的慢性综合疾病，在发病过程中碳水化合物和脂肪代谢紊乱，影响全身各器官组织的正常生理活动。2型糖尿病病因源于胰岛素抵抗，主要的临床表现为多饮、多尿、多食和体质量下降，人体肠道内产丁酸的细菌减少、条件致病菌增多，可增加肠道内的炎症反应，导致胰岛素抵抗，进而罹患2型糖尿病。

2、2型糖尿病现有的传统治疗方式以口服类药物为主：如磺酰脲类、格列奈类、双胍类、噻唑烷二酮类和α-葡萄糖苷酶抑制剂类等。长期应用这种治疗方法易引起一些副作用，如腹泻、头晕、恶心、食欲不振、低血糖和肝功能损伤等，严重威胁人们的健康。此外，注射胰岛素或胰岛素类似物也是降低血糖的途径。然而每日多次注射药物给糖尿病患者带来了痛苦，价格高昂且伴有低血糖的不良反应。因此，探索更加安全、更加有效，同时又经济的方法缓解糖尿病的症状对于当前形势是十分必要的，特别是目前糖尿病患者的年龄有低龄化普遍化趋势，因此安全有效的疗法尤为重要。近年来，益生菌与益生元由于其安全性、易获得、成本低廉和无副作用等特点，逐渐成为糖尿病防治的研究热点。益生菌和益生元的混合制剂，它既可发挥益生菌的生理活性，又能选择性地增加益生菌数量，使其作用更加显著和持久。

3、中国专利申请cn107156587a公开了一种活性益生菌固体饮料及其在治疗2型糖尿病中应用，其活性益生菌固体饮料包括罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌、库拉索芦荟凝胶粉、抗性糊精、低聚半乳糖和辅料。轻中度2型糖尿病患者服用后，短期指标空腹血糖和餐后2小时血糖和长期指标糖化血红蛋白都有明显的降低，并且同时具有降血脂功效，能够有效的降低胆固醇、降低甘油三酯、提高高密度脂蛋白、降低低密度脂蛋白。但是其添加了甜味剂，甜味剂可影响内分泌与机体代谢，增加患糖尿病并发症的风险。

4、中国专利cn110150669b公开了一种适于糖尿病患者食用的益生菌组合物及其应用，所提供的益生菌组合物的组成包括植物乳杆菌为植物乳杆菌ymc1005，嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌la28，乳双歧杆菌为乳双歧杆菌bal531，以及益生元。所述益生元选自抗性淀粉、抗性糊精、低聚果糖、菊粉、低聚木糖、低聚半乳糖、水苏糖、β-葡聚糖、葡萄籽粉、木聚糖、阿拉伯半乳聚糖中的任意一种或多种。该益生菌组合物可作为功能性食品供2型糖尿病患者食用，能够改善2型糖尿病患者的血糖状况，食用方便且安全可靠。但是仅为益生菌和益生元组合，没有调节口感和香味的辅料，且所用益生菌数量较少，真正在肠道发挥作用的菌数量则更少。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提出一种预防及控制糖尿病的益生菌组合物及其制备方法，原料来源广，均为食品级原料，安全性高，具有很好的抗氧化、抗炎效果，能够很好的起到调控血糖、血脂等作用，是一种很好的预防及控制2型糖尿病的产物，将具有广阔的应用前景。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、本发明提供一种预防及控制糖尿病的益生菌组合物的制备方法，提取黑木耳、香菇多糖并硫酸化改性制得硫酸化改性多糖；将诺丽果渣、黑莓果渣、紫皮大蒜经过深共熔溶剂提取获得活性多酚-黄酮；将青稞和米糠酶解，金属离子螯合，获得螯合mg-zn-青稞-米糠蛋白肽；将上述过程中产生的固渣中接种发酵菌发酵，过滤，固体洗涤收集发酵菌液，滤液冷冻干燥获得发酵产物，发酵菌液与益生元、螯合mg-zn-青稞-米糠蛋白肽混合包埋制得益生菌-益生元-蛋白肽包埋颗粒，与发酵产物、硫酸化改性多糖、活性多酚-黄酮混合制得预防及控制糖尿病的益生菌组合物。

4、作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：

5、s1.活性多糖的提取：将黑木耳、香菇分别洗净，干燥，粉碎，得到混合粉1，加入水中，加热至沸提取，过滤，收集固体1，滤液中加入乙醇沉淀，离心，收集固体，洗涤，干燥，得到活性多糖；

6、s2.硫酸化改性多糖：在冰水浴条件下，将浓硫酸和正丁醇混合，加入硫酸铵和步骤s1制得的活性多糖，搅拌反应，调节溶液ph值为中性，加入乙醇沉淀，离心，收集沉淀，洗涤，干燥，制得硫酸化改性多糖；

7、s3.活性多酚-黄酮的提取：将诺丽果渣、黑莓果渣、紫皮大蒜分别洗净，干燥，粉碎混合，得到混合粉2，加入深共熔溶剂和乙醇溶液，超声波辅助加热提取，离心，过滤，收集固体2，滤液采用大孔树脂对多酚和黄酮进行富集回收，将获得的多酚和黄酮混合均匀，制得活性多酚-黄酮；

8、s4.酶解蛋白肽的制备：将青稞和米糠洗净，干燥，粉碎混合均匀，得到混合粉3，加入水中，加入复合酶酶解，过滤，收集固体3，滤液透析，透析液冷冻干燥，制得青稞-米糠蛋白肽；

9、s5.金属离子螯合：将步骤s4制得的青稞-米糠蛋白肽溶于水中，加入锌盐和镁盐，搅拌反应，透析，透析液冷冻干燥，制得螯合mg-zn-青稞-米糠蛋白肽；

10、s6.发酵菌的活化：将乳双歧杆菌bla019、长双歧杆菌bl5b、短双歧杆菌bb033分别接种至高氏培养基中，缺氧条件下活化培养，制得的菌种种子液；

11、s7.发酵：将固体1、固体2、固体3混合加入水中，灭菌，接种步骤s6制得的乳双歧杆菌bla019、长双歧杆菌bl5b、短双歧杆菌bb033菌种种子液，缺氧条件下发酵培养，过滤，固体洗涤，收集菌液，浓缩，得到混合菌液；滤液冷冻干燥，制得发酵产物；

12、s8.益生元的制备：将菊粉、海藻酸钠、羧甲基茯苓多糖混合均匀，制得益生元；

13、s9.包埋：将步骤s5制得的螯合mg-zn-青稞-米糠蛋白肽加入步骤s7中制得的混合菌液中，加入步骤s7制得的益生元和卵磷脂，搅拌混合均匀，制得水相；将水相加入鱼油中，乳化，滴加氯化钙溶液，常温固化，离心，洗涤，干燥，制得益生菌-益生元-蛋白肽包埋颗粒；

14、s10.预防及控制糖尿病的益生菌组合物的制备：将步骤s2制得的硫酸化改性多糖、步骤s3制得的活性多酚-黄酮、步骤s7制得的发酵产物、步骤s9制得的益生菌-益生元-蛋白肽包埋颗粒混合均匀，制得预防及控制糖尿病的益生菌组合物。

15、作为本发明的进一步改进，步骤s1中所述黑木耳、香菇的质量比为7-10:3-5，所述混合粉1和水的固液比为1:5-7g/ml，所述提取的时间为3-5h，所述加入乙醇至体系乙醇含量为75-85wt％，沉淀时间为2-4h；步骤s2中所述浓硫酸、正丁醇、硫酸铵和活性多糖的质量比为22-35：7-10：0.3-0.5：3-5，所述搅拌反应的时间为0.5-1h，所述加入乙醇至体系乙醇含量为75-85wt％，沉淀时间为2-4h。

16、作为本发明的进一步改进，步骤s3中所述诺丽果渣、黑莓果渣、紫皮大蒜的质量比为10-12:7-10:5-7，所述混合粉2、深共熔溶剂和乙醇溶液的质量比为10-12:15-20:12-15，所述乙醇溶液的浓度为50-60wt％，所述深共熔溶剂为乳酸和氯化胆碱，摩尔比为1.8-2.2:1，所述超声波辅助加热提取的温度为55-65℃，时间为1-2h，超声波功率为1200-1500w，所述大孔树脂选自nka-9、d101、hpd600、xda-2、x-5、lsa-10、nki-9、sp-825、ab-8中的至少一种；步骤s4中所述青稞和米糠的质量比为12-15:3-5，所述混合粉3和水的固液比为1:3-5g/ml，所述复合酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，质量比为5-7:1-2，所述复合酶的添加量为体系总质量的1-2wt％，所述酶解的温度为45-50℃，时间为2-4h，所述透析用的透析袋孔径为3-5kda，透析时间为2-4h。

17、作为本发明的进一步改进，步骤s5中所述青稞-米糠蛋白肽、锌盐和镁盐的质量比为15-20:1-2:2-4，所述镁盐选自氯化镁、硫酸镁、硝酸镁中的至少一种，所述锌盐选自氯化锌、硫酸锌、硝酸锌中的至少一种，所述搅拌反应的时间为20-30min，所述透析用的透析袋孔径为3-5kda，透析时间为2-4h；步骤s6中所述活化培养的条件为36-38℃，150-200r/min，活化培养24-28h，所述菌种种子液的含菌量为108-109cfu/ml。

18、作为本发明的进一步改进，步骤s7中所述固体1、固体2、固体3和水的质量比为10-12:7-10:5-7:500，所述乳双歧杆菌bla019、长双歧杆菌bl5b、短双歧杆菌bb033菌种种子液的接种量分别为1-3v/v％、1-2v/v％、2-3v/v％，所述发酵培养的条件为36-38℃，120-150r/min，发酵培养48-56h，所述混合菌液中含菌量为1010-1011cfu/ml；步骤s8中所述菊粉、海藻酸钠、羧甲基茯苓多糖的质量比为4-6:12-15:3-5。

19、作为本发明的进一步改进，步骤s9中所述螯合mg-zn-青稞-米糠蛋白肽、混合菌液、益生元和卵磷脂的质量比为5-7:30-50:15-17:0.5-1；步骤s10中所述硫酸化改性多糖、活性多酚-黄酮、发酵产物、益生菌-益生元-蛋白肽包埋颗粒的质量比为3-5:2-4:7-10:10-12。

20、作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：

21、s1.活性多糖的提取：将7-10重量份黑木耳、3-5重量份香菇分别洗净，干燥，粉碎，得到混合粉1，加入水中，所述混合粉1和水的固液比为1:5-7g/ml，加热至沸提取3-5h，过滤，收集固体1，滤液中加入乙醇至体系乙醇含量为75-85wt％，沉淀2-4h，离心，收集固体，洗涤，干燥，得到活性多糖；

22、s2.硫酸化改性多糖：在冰水浴条件下，将22-35重量份浓硫酸和7-10重量份正丁醇混合，加入0.3-0.5重量份硫酸铵和3-5重量份步骤s1制得的活性多糖，搅拌反应0.5-1h，调节溶液ph值为中性，加入乙醇至体系乙醇含量为75-85wt％，沉淀2-4h，离心，收集沉淀，洗涤，干燥，制得硫酸化改性多糖；

23、s3.活性多酚-黄酮的提取：将10-12重量份诺丽果渣、7-10重量份黑莓果渣、5-7重量份紫皮大蒜分别洗净，干燥，粉碎混合，得到混合粉2，将10-12重量份混合粉2加入15-20重量份深共熔溶剂和12-15重量份50-60wt％的乙醇水溶液，1200-1500w超声波辅助，加热至55-65℃，提取1-2h，离心，过滤，收集固体2，滤液采用大孔树脂对多酚和黄酮进行富集回收，将获得的多酚和黄酮混合均匀，制得活性多酚-黄酮；

24、所述深共熔溶剂为乳酸和氯化胆碱，摩尔比为1.8-2.2:1；

25、采用大孔树脂ab-8对黄酮进行富集回收，采用nka-2对多酚进行富集回收；

26、s4.酶解蛋白肽的制备：将12-15重量份青稞和3-5重量份米糠洗净，干燥，粉碎混合均匀，得到混合粉3，加入水中，所述混合粉3和水的固液比为1:3-5g/ml，加入复合酶，添加量为体系总质量的1-2wt％，45-50℃酶解2-4h，过滤，收集固体3，滤液用孔径为3-5kda的透析袋透析2-4h，透析液冷冻干燥，制得青稞-米糠蛋白肽；

27、所述复合酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，质量比为5-7:1-2；

28、s5.金属离子螯合：将15-20重量份步骤s4制得的青稞-米糠蛋白肽溶于200重量份水中，加入1-2重量份锌盐和2-4重量份镁盐，搅拌反应20-30min，用孔径为3-5kda的透析袋透析2-4h，透析液冷冻干燥，制得螯合mg-zn-青稞-米糠蛋白肽；

29、s6.发酵菌的活化：将乳双歧杆菌bla019、长双歧杆菌bl5b、短双歧杆菌bb033分别接种至高氏培养基中，缺氧条件下，36-38℃，150-200r/min，活化培养24-28h，制得的菌种种子液，含菌量为108-109cfu/ml；

30、s7.发酵：将10-12重量份固体1、7-10重量份固体2、5-7重量份固体3混合加入500重量份水中，灭菌，接种步骤s6制得的乳双歧杆菌bla019、长双歧杆菌bl5b、短双歧杆菌bb033菌种种子液，接种量分别为1-3v/v％、1-2v/v％、2-3v/v％，缺氧条件下，36-38℃，120-150r/min，发酵培养48-56h，过滤，固体洗涤，收集菌液，浓缩，得到混合菌液，含菌量为1010-1011cfu/ml；滤液冷冻干燥，制得发酵产物；

31、s8.益生元的制备：将4-6重量份菊粉、12-15重量份海藻酸钠、3-5重量份羧甲基茯苓多糖混合均匀，制得益生元；

32、s9.包埋：将5-7重量份步骤s5制得的螯合mg-zn-青稞-米糠蛋白肽加入30-50重量份步骤s7中制得的混合菌液中，加入15-17重量份步骤s7制得的益生元和0.5-1重量份卵磷脂，搅拌混合均匀，制得水相；将100-120重量份水相加入200重量份鱼油中，乳化，滴加20重量份5-7wt％的氯化钙溶液，常温固化20-30min，离心，洗涤，干燥，制得益生菌-益生元-蛋白肽包埋颗粒；

33、s10.预防及控制糖尿病的益生菌组合物的制备：将3-5重量份步骤s2制得的硫酸化改性多糖、2-4重量份步骤s3制得的活性多酚-黄酮、7-10重量份步骤s7制得的发酵产物、10-12重量份步骤s9制得的益生菌-益生元-蛋白肽包埋颗粒混合均匀，制得预防及控制糖尿病的益生菌组合物。

34、本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的预防及控制糖尿病的益生菌组合物。

35、本发明进一步保护一种上述预防及控制糖尿病的益生菌组合物在制备预防、治疗及辅助治疗2型糖尿病的食品及药品中的应用。

36、本发明具有如下有益效果：

37、黑木耳、香菇中富含降血糖的活性多糖，具有促进胰岛素分泌和增强胰岛素敏感性的能力，降低氧化应激和炎症反应，从而改善β细胞损伤。将该活性多糖提取后，经过硫酸化改性，进一步提高了改性后的多糖的稳定性，提高了其抗氧化、降血糖、调节血脂等活性，具有很好的抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶等活性酶的效果，通过抑制这些酶的活性，减少摄入的淀粉食物分解为低聚糖，在进一步由小肠中的α-葡萄糖苷酶转化为单糖从而抑制食物转化为单糖入血吸收所导致的血糖升高，以及诱导肝细胞生产胰岛素，从而能够很好的平稳餐后血糖。另外，改性多糖还可以上调益生菌，促进短链脂肪酸的生成等，促进大鼠的肠道蠕动，降低其肠道内的酸碱度，为益生菌提供良好的生存环境，促进体内短链脂肪酸(乙酸、丙酸、异丁酸等)的含量增加并且降低血糖。

38、诺丽是一种含有维生素、氨基酸、酚类化合物、有机酸、多糖、生物碱、蒽醌、环烯醚萜类化合物、莨菪亭等多种功能活性成分的水果，具有很好的抗肿瘤、抗血栓、抗菌、降血糖活性以及激活免疫系统、中和自由基、平衡细胞功能、清洁血液和调节胆固醇等活性；黑莓果也中富含花色苷、黄酮等活性物质，具有抗氧化、降血糖、预防炎症疾病和心血管疾病及抗癌的效果。紫皮大蒜富含含硫化合物、挥发油、氨基酸、多糖、维生素、皂苷类化合物、多酚类化合物、黄酮类化合物、生物活性酶及微量元素等，具有很好的抗炎、抗氧化、降血糖、防治心血管疾病、抗肿瘤、降血脂等活性。本发明将工业化中榨汁后的果渣(诺丽果渣、黑莓果渣)进行废物利用，与紫皮大蒜一同提取出其具有很好的抗炎、抗氧化活性的多酚组合物和黄酮组合物，通过深共熔溶剂进行提取，经济、无毒、可回收、环境友好，且对多酚和黄酮的提取率高，在超声波的辅助提取下，大大提高了对原来中多酚和黄酮的提取率，获得的活性多酚-黄酮具有很好的抗氧化、抗炎活性，对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶等有很好的抑制活性，也起到了很好的调控血糖的作用。

39、青稞和米糠中含有丰富的蛋白质，通过对其进行酶解获得的小分子蛋白肽有很好的有降血糖、降血脂、抗炎、抗氧化活性，且小分子结构，使得更容易被人体吸收，进一步将制得的蛋白肽与微量元素离子mg离子和zn离子通过配位键螯合后，获得了含有微量元素mg、zn的蛋白肽，镁或锌元素可以促进胰岛素分泌，从而起到调控血糖的效果。

40、益生菌通过调节肠道菌群平衡、肠道免疫、微生物-肠-脑轴、微生物-肠-肝轴等调控血糖。本发明添加的乳双歧杆菌bla019、长双歧杆菌bl5b、短双歧杆菌bb033可以协同作用，起到很好的调节血糖的作用，一方面，这些益生菌进入肠道后，能够迅速增殖，消耗葡萄糖，通过降低慢性低度炎症，降低血清脂多糖、游离脂肪酸、tnf-α、il-6、il-8水平和升高il-10水平，显著改善血清脂多糖诱导的炎症状态，减少氧化应激，改善胰岛素抵抗等达到调控血糖的作用。同时，这些益生菌能够产生大量的后生元，包括微生物代谢物、蛋白质、脂类、碳水化合物、维生素、有机酸、细胞壁成分或其他复杂分子等，参与免疫调节或刺激肠道细胞发挥作用，其中醋酸盐已被证明可以通过调节空腹胰岛素和胰高血糖素水平来减少炎症和胰岛素敏感性并改善葡萄糖耐量。细菌壁成分中的二肽可以调节glp-1的分泌，通过nod2受体改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐量。组合菌、合生菌、后生元具有良好的生物活性，对2型糖尿病等代谢性疾病具有预防和缓解作用，细菌素能够起到保护胰岛、促进胰岛功能发挥、抑制α-葡萄糖苷酶等发挥调控血糖的作用。

41、本发明添加的益生菌还可以通过对前序步骤的固体废渣进行发酵，进一步将细胞壁破裂，促进植物内活性组分的溶出，以及产生大量的短链脂肪酸等物质，获得的发酵产物同样具有很好的抗氧化、抗炎作用，能够很好的起到调控血糖、血脂等代谢作用。

42、但是，益生菌如果直接进入人体，常常会被胃酸破坏失活，而不能顺利到达肠道，发挥出其效果，因此，本发明将益生菌和螯合蛋白肽经过包埋，一方面，包埋的壁材是一类多糖物质，混合包埋后具有很好的耐胃酸、耐胆碱的效果，另一方面，这些多糖类壁材也是一种很好的益生元，在肠道被降解破裂后，里面的益生菌溶出，定殖于肠道，破裂的益生元壁材能够被益生元有效利用，从而大大促进了益生菌的繁殖以及对短链脂肪酸等后生元的分泌，极大的促进了益生菌对血糖的调控作用，而蛋白肽也避免了胃酸的作用失活，进入肠道能够被人体直接吸收，发挥出很好的抗氧化、抗炎、调节血糖的作用。

43、本发明制备的预防及控制糖尿病的益生菌组合物原料来源广，均为食品级原料，安全性高，具有很好的抗氧化、抗炎效果，能够很好的起到调控血糖、血脂等作用，是一种很好的预防及控制2型糖尿病的产物，将具有广阔的应用前景。