一种自体纤维蛋白凝胶支架及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种自体纤维蛋白凝胶支架及其制备方法和应用。

背景技术：

1、本节中的陈述仅提供与本技术公开相关的背景信息，并且可能不构成现有技术。

2、年轻恒牙（immature tooth)是指萌出3-5年内根尖未发育完全的恒牙，常因龋病、外伤导致牙髓坏死或者根尖周炎，继而牙根停止发育。牙齿的大部分生物活性主要依赖于牙髓，目前，用惰性合成材料覆盖或替换，即根管治疗是治疗牙髓疾病的主要途径。较常见的充填材料是杜仲胶，杜仲胶是一种异戊二烯热塑性聚合物。治疗时，将坏死的牙髓取出后，熔化的热牙胶被注入到牙根管中。尽管根管治疗术近年来被广泛应用于牙体治疗，但仍然存在如下弊端：根管治疗后的牙体脆性增加，易折断；根管治疗后的牙齿频繁发生脱色，后期牙科美容手术费用高昂；尚无适用于婴儿的患病牙髓根管治疗方法。而且脱位牙发生牙髓坏死的概率为85-96％，挫入牙发生牙髓坏死的概率为70-100％。被忽视的牙体炎症可能是全身性感染的诱因。基于牙髓干细胞的牙髓再生术为年轻恒牙牙髓、根尖周疾病的治疗提供了新的选择。

3、人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells，hdpscs)是指存在于人类乳牙/恒牙牙髓组织中的一种有多向分化潜能的干细胞，大部分的牙髓干细胞取自于需要拔除的正畸牙或者第三磨牙，具有来源稳定且无伦理争议等优点，在适宜条件下，牙髓干细胞可分化为骨、神经、脂肪、软骨等多种组织。

4、牙髓再生术是指利用支架将干细胞接种于需要治疗的部位，通过干细胞的进一步增殖和分化再次生长出牙髓。近年来随着对牙髓再生研究的不断深入，如何选择一种合适的材料作为干细胞生长支架是亟需解决的问题，现存的支架材料多为人工合成或动物来源取材，工序繁琐且成本高昂，培养效果有限。患者自体血来源的纤维蛋白凝胶采用高速离心的方法从患者的自体血液中收集，室温下快速凝结成为凝胶状，具有稳定的3d支架结构供干细胞黏附生长，富含成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor)，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor)，转化生长因子-β(transforming growthfactor-β)等，这些细胞因子能在患牙内稳定释放，持续促进牙髓干细胞增殖并分化为牙髓样细胞。

5、自体纤维蛋白凝胶虽然具有以上效果，但现有的自体纤维蛋白凝胶在稳定性、便捷性和实用性等方面仍然有待进一步提升。

技术实现思路

1、本发明的目的在于：针对目前自体纤维蛋白凝胶制备繁琐、费用高昂、性能不稳定等缺点，提供了一种自体纤维蛋白凝胶支架及其制备方法和应用，提升制备的自体纤维蛋白凝胶的组织相容性和稳定性，能够延长自体纤维蛋白凝胶的稳定性能。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种自体纤维蛋白凝胶支架的制备方法，包括如下步骤：

4、步骤s1：分别取两管等体积的患者的静脉血，第一管于4℃2000r/min离心3分钟，上层为粘稠黄色液体；第二管于4℃2700 r/min离心12分钟；分别取第一管离心后的全部上层黄色液体和第二管离心后的全部中层液体合并；

5、步骤s2：按照体积比加入1.5%的苯甲醇；

6、步骤s3：按照体积比加入2%-5%的人血白蛋白；混合均匀即得患者自体纤维蛋白支架。将其置于4℃保存，有效期为3个月，可以满足多次使用的需要。

7、优选地，步骤s1中，所述第一管于4℃2000 r/min离心3分钟的操作中使用内壁光滑的无任何添加剂的塑料试管。

8、优选地，步骤s1中，所述第二管于4℃2700 r/min离心12分钟的操作中使用无任何添加剂的玻璃试管。

9、优选地，步骤s3中加入的人血白蛋白的体积比优选为2.5%。

10、优选地，人血白蛋白的分子量为66kd。

11、第一管中分离获得2层，上层为自体纤维蛋白胶层（autologous fibrin glue，afg）,下层为红细胞层（液态）；第二管中获得3层，最上层为无细胞血浆，中间层为富血小板纤维蛋白凝块（platelet-rich fibrin, prf），最下层为红细胞层（固态凝胶）。

12、上述制备方法的有益之处在于：能够分离血液中不同密度的组分，第一管中分离出自体纤维蛋白胶层（autologous fibrin glue，afg），第二管中分离出富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin, prf）。afg含有生长因子可以使得骨粉变黏，而prf含有众多生长因子，如血小板衍生生长因子、转化生长因子β1、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、表皮生长因子等。这些生长因子有利于间充质干细胞的生长。

13、混合后的afg和prf能够加速黏性骨的形成，且具有更多的生产因子，更有利于间充质干细胞的生长。由于分子量的不同，液态的afg更容易和细胞结合；prf更容易形成纤维支架，发明人发现，单一使用afg或者prf都没有二者混合的效果。

14、使用注射器取第一管上层的afg与骨粉混合，5-10min可产生黏性骨；而在afg与骨粉混合时加入第二管中层的prf可加聚黏性骨的聚合，通常1min左右可形成黏性骨，且具有更多的生产因子。因此两步离心法和单步离心法比起来，极大的优化了骨粉的定植和细胞的生长分化效率。

15、本发明另一方面还提供一种自体纤维蛋白凝胶，采用如前所述的方法制备。

16、本发明另一方面还提供一种自体纤维蛋白凝胶的使用方法，包括如下步骤：取500μl纤维蛋白凝胶，与0.5x108个人牙髓干细胞混匀于无菌ep管中，轻轻混匀，然后置37℃放置5-10分钟，直至观察到细胞凝胶的形成，即可进行牙髓干细胞的装载。

17、本发明另一方面还提供一种自体纤维蛋白凝胶在制备干细胞凝胶制剂中的应用。

18、本发明另一方面还提供一种干细胞凝胶制剂，包括间充质干细胞和如前所述的纤维蛋白凝胶。

19、优选地，所述间充质干细胞为人牙髓干细胞。

20、优选地，所述人牙髓干细胞分离自患者临床上需要拔除的正畸或者阻生第三磨牙。

21、优选地，所述人牙髓干细胞取自14-18周岁拔除的健康完整的正畸牙或者第三磨牙，可异体使用细胞活性和增殖效果佳。

22、优选地，所述人牙髓干细胞的制备方法包括如下步骤：

23、步骤s1：采集前，牙冠进行消毒，拔除后立即放入装有生理盐水的离心管中，转移至工作台，用含盐水的无菌纱布包住牙根，用高速涡轮手机在釉牙骨质界处磨出凹槽，碘伏消毒后用生理盐水从牙根到牙冠方向冲洗干净后置于含15%双抗的pbs溶液离心管中，4℃运输箱运输，24h内处理。

24、步骤s2：在生物安全柜中用含双抗的pbs反复冲洗牙齿，直至牙面基本清洁无污物，将牙齿自牙颈部横向劈开，挑出牙髓组织，用含双抗的pbs将组织块漂洗干净，并用眼科剪剪碎成1mm3左右组织块。

25、步骤s3：将组织块按照合适的密度均匀接种于培养皿中，放置于37℃，5％的co2的培养箱中贴壁3h，添加含10%fbs的dmem/f12培养液静置于培养箱中培养，定期观察添加培养液。

26、步骤s4：在显微镜下观察，可见组织块周围有梭形纤维状细胞爬出，去除组织块，胰蛋白酶消化将贴壁细胞转移到培养瓶中培养后进行传代。

27、步骤s5：培养瓶中细胞生长达到70％融合时，胰蛋白酶消化，1∶2传代培养。选取p3、p4代生长状态良好的细胞离心，收集细胞沉淀，随后加入细胞冻存液，分装于冻存管中，液氮冷冻保存。

28、本发明另一方面还提供一种自体纤维蛋白凝胶支架在牙髓再生中的应用。

29、本发明另一方面还提供一种干细胞凝胶制剂在牙髓再生中的应用。

30、与现有的技术相比本发明的有益效果是：

31、一种自体纤维蛋白凝胶支架及其制备方法和应用，具有更好的组织相容性、稳定性和实用性；纤维蛋白凝胶取自患者自身的静脉血，用于干细胞支架时不需要进行额外的处理步骤即可直接运用，方便且安全性高；加入了苯甲醇提升了纤维蛋白凝胶的稳定性；而使用两次离心后混合上清的方式使得制备的纤维蛋白凝胶能够更快形成黏性骨。