一种可以增强菌株环境耐受性且适于在口腔中释放的益生菌微胶囊制备方法和应用

本发明属于微生物，尤其是一种可以增强菌株环境耐受性且适于在口腔中释放的益生菌微胶囊制备方法和应用。

背景技术：

1、2001年，fao/who正式将益生菌定义为“活的微生物，足量摄入后对宿主的健康有益”。2013年，国际益生菌和益生元科学协会(isapp)在fao/who定义的基础上进行了简单修改，并强调了益生菌菌株鉴定和安全性评价的重要性。近年来，益生菌在胃肠道的应用研究较为深入，但是口腔作为多样性排名第二的人体微生物区系，其益生菌的应用亟待发展。因此，益生菌在减轻口腔疾病和维护口腔健康方面的作用越来越受到关注。

2、目前应用的口腔益生菌大致可分为乳酸菌类益生菌(如双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属)，非乳酸菌类益生菌(如肠球菌属、链球菌属和酵母菌属)。口腔益生菌对龋齿、牙周炎、口臭、咽扁桃体炎、口腔黏膜炎等口腔疾病都有积极的防治效果，对维持口腔生态平衡起着至关重要的作用。

3、益生菌使用面临两大共性难题：一是如何保存菌株活性，二是如何到达目标部位并有效释放和定植。益生菌的活性受到生产(温度、氧气、剪切力等)和储存(水分、氧气、包装和储存温度)的显著影响，并且当食用活菌的数量高于或等于每毫升或每克产品7logcfu时，益生菌的治疗效果才会显现。因此，使用保护性封装材料是保护益生菌免受恶劣环境影响并确保足够量的活菌到达目标部位的重要策略。

4、淀粉作为一种安全性好、价格便宜、容易获取的天然原材料，在食品及其他领域都获得了广泛应用。多孔淀粉是一种改性淀粉，作为益生菌包封材料，在口腔益生菌使用方面具有非常好的潜力。一方面，多孔淀粉的多孔结构使其比表面积增大，吸附能力得到增强，而且这些孔隙提供的空间，可作为封装益生菌的保护微环境。另一方面，负载益生菌的多孔淀粉可被口腔中天然存在的唾液淀粉酶水解，充分释放孔洞里的益生菌，使益生菌更好地定植于口腔环境中。这将有利于扩大口腔益生菌在缓解及治疗口腔疾病、改善口腔微生态的应用范围。

5、当前技术制备的益生菌微胶囊主要存在以下问题：一、大多益生菌微胶囊包埋技术是针对胃肠道益生菌开发的，包埋所采用的壁材或保护剂配方主要是针对胃肠道环境研制的，其成分复杂、价格昂贵，而且不利于益生菌在口腔环境中的释放和定植；二、超声波辅助酶解法是目前生产多孔淀粉的常规方法，然而超声波设备复杂，噪音大，耗能高，而且高强度超声波会破坏酶的微观结构并使其失活。

6、因此，需要专门针对益生菌在口腔环境中的释放开发一种微胶囊材料，而且其应该能够耐受高温等恶劣环境条件，提高贮藏过程中益生菌的存活率；同时，这种益生菌包埋材料的制备过程应该避免复杂设备和高能耗，更加简便、绿色。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种可以增强菌株环境耐受性且适于在口腔中释放的益生菌微胶囊制备方法和应用。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种可以增强菌株环境耐受性且适于在口腔中释放的益生菌微胶囊制备方法和应用，包括如下步骤：

4、(1)益生菌培养后离心收集菌体，制备菌悬液；

5、(2)复合酶水解制备多孔淀粉壁材；

6、(3)将多孔淀粉壁材与菌悬液混合，搅拌后离心分离制备湿微胶囊；

7、(4)将湿微胶囊真空冷冻干燥得到耐受性强且适于在口腔中释放的益生菌微胶囊。

8、进一步地，所述菌悬液的浓度为1.0×109～1.0×1010cfu/ml；

9、或者，所述步骤(1)中益生菌为唾液链球菌k12(streptococcus salivariusk12)、唾液链球菌m18(streptococcus salivarius m18)、植物乳杆菌lpl28(lactobacillusplantarum lpl28)、罗伊氏乳杆菌dsm 17938(lactobacillus reuteridsm 17938)或长双歧杆菌r0175(bifidobacterium longum r0175)。

10、进一步地，所述步骤(2)中多孔淀粉壁材中淀粉的质量浓度为10％～40％(w/v)。

11、进一步地，所述复合酶为α-淀粉酶和糖化酶，两者质量配比1:1～7，且复合酶质量占所用淀粉质量的1％～7％。

12、进一步地，所述步骤(3)中多孔淀粉、菌悬液的比例g:ml为1～3:5～50。

13、进一步地，步骤(3)中多孔淀粉与菌悬液均匀混合，搅拌速率为100r/min～150r/min，搅拌时间为10min～40min。

14、进一步地，所述湿微胶囊在低温冰箱中在温度-78～-82℃的条件下预先冷冻8～15h。

15、预冷冻的湿微胶囊在真空冷冻干燥机中在温度-65～-80℃、真空度1～5mtorr、降温速率：3～5℃/min的条件下冷冻干燥6～10h。

16、进一步地，具体步骤如下：

17、(1)益生菌培养后离心收集菌体，制备菌悬液：将益生菌接种在斜面固体培养基上于37℃条件下培养14～18h，活化3次，然后按1％接种量分别移入液体培养基中于37℃条件下扩大培养20～28h；采用转速4000～5000r/min进行离心分离10～15min收集菌泥，再用质量浓度为0.1％的无菌蛋白胨水洗涤3次，然后重悬得到浓缩菌液；

18、(2)复合酶水解制备多孔淀粉壁材：将天然玉米淀粉加入到ph为5.0～6.0的0.1m乙酸钠缓冲液中，制备质量浓度为15～40％的淀粉悬浮液；将淀粉悬浮液在45～55℃水浴恒温振荡器中预热静置10min；称取复合酶，再用0.1m乙酸钠缓冲液配成质量浓度为10％的酶液，将酶液全部转移到淀粉悬浮液中并准确计时，水浴恒温200r/min，匀速搅拌6～10h；搅拌结束后，快速加入95％乙醇使酶失活，终止反应；4000r/min离心10min，将沉淀水洗两次，然后将淀粉沉积物转移到培养皿中，在40℃恒温干燥箱中烘干至恒重，使用研钵将干燥后的淀粉样品磨碎并过100目筛网，得到玉米多孔淀粉壁材；

19、(3)将多孔淀粉壁材与菌悬液混合，搅拌后离心分离制备湿微胶囊：将多孔淀粉用紫外线照射灭菌10～30min，将灭菌多孔淀粉壁材置于菌悬液中，混合后匀速搅拌，1000r/min离心5min，收集沉淀，得到吸附益生菌的多孔淀粉菌泥，即湿微胶囊；

20、(4)将湿微胶囊真空冷冻干燥得到冻干菌粉：将步骤(3)得到的湿微胶囊放入低温冰箱中预先冷冻，再置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，得到所述的益生菌微胶囊冻干粉。

21、如上所述的制备方法制备得到的益生菌微胶囊，所述益生菌微胶囊中的益生菌存活率达95％以上，活菌数超过9.0logcfu/g；颗粒均匀且平均粒径为15μm；益生菌微胶囊在80℃水浴保温20min，益生菌活菌数大于7.0logcfu/g；在低温4℃贮藏8周后，益生菌的活菌数大于9.0log cfu/g，在常温25℃贮藏8周后，活菌数大于8.0log cfu/g；在人工唾液中孵育20min，活菌释放率达90％以上。

22、如上所述的益生菌微胶囊在口腔环境中的应用。

23、本发明取得的优点和积极效果为：

24、1、本发明方法制备的多孔淀粉口腔益生菌微囊使得益生菌冻干后存活率仍然达到95％以上，活菌数超过9.0logcfu/g；微胶囊冻干粉混悬液在80℃水浴保温20min益生菌活菌数大于7.0logcfu/g；在低温4℃贮藏8周后，益生菌的活菌数大于9.0logcfu/g，在常温25℃贮藏8周后，活菌数大于8.0logcfu/g。即本发明方法制备出来的多孔淀粉的孔径较大，平均可达1μm，比表面积和比孔容较高，分别是天然淀粉的2.2倍和3倍，显著提高了被包埋益生菌的数量、冻干后存活率和环境耐受性。

25、2、本发明方法制备的多孔淀粉口腔益生菌微囊在人工唾液中孵育20min，活菌释放率达90％以上。即本发明制备的多孔淀粉/口腔益生菌微囊适用于口腔生理环境和功能，微胶囊可在唾液淀粉酶水解作用下，充分释放被包埋的益生菌于口腔环境中，淀粉和口腔黏膜之间的粘附作用使得微胶囊不易被快速吞咽，可较长时间停留在口腔黏膜上，促进益生菌的定植。

26、3、本发明方法中制备的多孔淀粉壁材是包埋口腔益生菌的唯一载体，原料丰富且价格低廉。

27、4、本发明采用复合酶法制备的多孔淀粉，均匀度好，平均粒径约15μm，生产工艺简单，耗能低，成本较低，便于工业化生产，进一步拓宽了多孔淀粉的应用范围，具有重要的经济意义。