一种金纳米颗粒及其在肿瘤细胞焦亡诱导中的应用

本发明涉及生物医药领域，具体公开了一种金纳米颗粒及其在肿瘤细胞焦亡诱导中的应用。

背景技术：

1、目前，癌症的治疗方法主要包括手术、化疗、放疗以及近年来新兴的免疫治疗和分子靶向治疗，但它们都存在一定的限制。手术治疗是最早出现和最常用的局部肿瘤治疗方式之一，对早期肿瘤效果良好，但对于转移性肿瘤则无法根治。化疗是一种全身性的治疗方法，利用化学药物的毒性来杀灭癌细胞，但也会对一些正常细胞造成损害。放疗则使用放射线辐射肿瘤细胞的dna，对于一些局部肿瘤和高放射敏感的肿瘤效果较好，但对于放射不敏感的肿瘤效果有限。免疫治疗和分子靶向治疗近年来取得了显著进展，具有较好的治疗效果和较小的毒副作用，但治疗费用高，而且不同患者的反应存在很大差异。

2、光动力学治疗(photodynamic therapy，pdt)是上个世纪七十年代末新兴的一种肿瘤治疗技术，曾被称为“第四大肿瘤治疗方式”。它的主要原理是利用光敏剂(photosensitizer，ps)在特定波长的光照射下产生活性氧自由基，从而对肿瘤细胞和组织造成损伤，以达到抑制肿瘤的效果。光动力学治疗的优势在于其选择性良好，美容效果明显，保护重要器官功能，毒性反应轻微，且没有耐药性等特点。

3、传统的光敏剂通常需要可见光来激发，其穿透深度有限(<3mm)，因此对于深层和实体肿瘤的治疗效果有限。解决这个问题的一种策略是使用近红外光(nir)激发的光敏剂，因为nir位于生物组织的光学窗口内，可以提供更深层(～2cm)的肿瘤治疗，同时降低对健康组织的光毒性。

4、近年来，细胞焦亡，又被称为细胞炎性坏死，已成为一种新兴的程序性细胞死亡方式。它的形态特征包括细胞持续膨胀，最终导致细胞膜破裂，释放细胞内容物，从而引发强烈的免疫炎症反应。细胞焦亡因其能够激活免疫系统而受到越来越多的研究关注，成为了新的研究热点。

技术实现思路

1、本发明提供一种金纳米颗粒及其在肿瘤细胞焦亡诱导中的应用，即基于金纳米颗粒的双光子光动力诱发肿瘤细胞焦亡、进而诱发机体抗肿瘤免疫。解决目前肿瘤治疗方式的局限性、丰富金纳米颗粒的应用场景。

2、为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

3、本发明提供一种金纳米颗粒l-aunp@tmt，尺寸大于2nm，且具有如下任一项或几项特点：

4、1)在520nm处无吸收峰，不存在表面等离子体共振现象；

5、2)具有优异的光致发光现象，最适激发波长为467nm，和/或，荧光光谱为500—600nm；

6、优选的，l-aunp@tmt金核尺寸为2.75±0.47nm。本发明所使用的金纳米颗粒l-aunp@tmt，大于金纳米团簇(≤2nm)的尺寸，但具有类似金纳米团簇的性质。

7、本发明所述金纳米颗粒l-aunp@tmt的制备方法包括：

8、1)在避光条件下，将水合氯金酸的水溶液与(5-巯基-1，3，4-噻二唑-2-基硫代)乙酸的氢氧化钠水溶液进行混合，得到均匀的混合物；

9、2)将步骤1)得到的混合物于阳光下进行反应，得到(5-巯基-1，3，4-噻二唑-2-基硫代)乙酸保护的金纳米颗粒(简写为l-aunp@tmt)溶液。优选的，所述氯金酸、(5-巯基-1，3，4-噻二唑-2-基硫代)乙酸与氢氧化钠的摩尔比为1:2:10～12。

10、优选的，所述混合物中，氯金酸根离子浓度为0.98～1毫摩/升。

11、优选的，反应过程中，采用光致发光谱监测反应进程。

12、优选的，所述反应时间为65～75分钟。

13、优选的，反应所得金纳米颗粒溶液采用超纯水洗涤并离心后得到金纳米颗粒浓缩物。

14、优选的，将所述金纳米颗粒浓缩物冻干后避光保存。

15、本发明还提供颗粒尺度大于2nm的(5-巯基-1，3，4-噻二唑-2-基硫代)乙酸保护的金纳米颗粒。

16、优选的,所述金纳米颗粒无等离子共振吸收。

17、本发明还提供一种光敏剂，所述光敏剂为金纳米颗粒l-aunp@tmt；

18、优选的，所述光敏剂为所述金纳米颗粒l-aunp@tmt；

19、优选的，所述光敏剂用于光动力学治疗；

20、优选的，所述光敏剂为双光子光敏剂。本发明主要应用的是金纳米颗粒l-aunp@tmt的双光子性质。近红外光与可见光相比，组织穿透能力较强且光毒性小，双光子光敏剂在光子密度足够高时，可同时吸收两个波长较长、能量较低的光子而到达激发态。l-aunp@tmt是一种优异的双光子光敏剂。以本发明所述金纳米颗粒为光敏剂的双光子光动力学诱导肿瘤细胞焦亡，治疗系统安全性高。

21、本发明还提供一种试剂盒，包括所述金纳米颗粒l-aunp@tmt或所述光敏剂。

22、本发明还提供所述金纳米颗粒l-aunp@tmt、所述光敏剂或所述试剂盒在制备用于光动力学治疗的光敏剂中的应用。

23、本发明还提供所述金纳米颗粒l-aunp@tmt、所述光敏剂或所述试剂盒的使用方法，包括利用飞秒脉冲激光照射金纳米颗粒l-aunp@tmt；

24、优选的，利用790±2nm飞秒脉冲激光照射；

25、进一步优选的，利用利用790±1nm飞秒脉冲激光照射；

26、优选的，790nm飞秒脉冲激光照射下双光子吸收截面可达2.05×105gm；

27、优选的，790nm的飞秒脉冲激光组织穿透能力强，穿透性可达到2cm；

28、优选的，功率密度为6.5-6.7w/cm2，进一步优选为6.6w/cm2。

29、本发明还提供所述金纳米颗粒l-aunp@tmt、所述光敏剂或所述试剂盒在以下任一项中的应用：

30、1)治疗肿瘤；

31、2)杀伤肿瘤细胞；

32、3)抑制肿瘤的生长或复发；

33、优选的，所述肿瘤是指肝、肺、呼吸道、胃肠道、颅内、眼或膀胱等部位的肿瘤；

34、优选的，细胞杀伤通过双光子光动力学诱导；

35、优选的，细胞的死亡方式为细胞焦亡；

36、优选的，用于活体小鼠；

37、优选的，通过控制飞秒脉冲的功率密度、l-aunp@tmt浓度、激光照射时间中的一种或几种来控制对细胞的杀伤能力。本发明的治疗肿瘤结果好，tp-pdt组的肿瘤体积与其它对照组相比，降低80％，且治疗组约50％的肿瘤达到治愈的效果，且不再复发。

38、本发明还提供所述金纳米颗粒l-aunp@tmt、所述光敏剂或所述试剂盒在产生活性氧自由基(ros)中的应用；

39、优选的，产生ros的机制为ⅰ、ⅱ型；

40、优选的，在有氧和/或无氧条件下产生ros；

41、优选的，l-aunp@tmt在790nm激光照射下，产生大量的活性氧自由基。

42、本发明还提供所述金纳米颗粒l-aunp@tmt、所述光敏剂或所述试剂盒在杀伤细胞中的应用；

43、优选在，l-aunp@tmt在790nm激光照射下具有很强的细胞杀伤能力；

44、优选的，细胞死亡方式为焦亡，焦亡死亡方式会导致细胞不断地膨胀直到细胞膜破裂，引起内容物的释放从而激活强烈的免疫炎症反应。

45、本发明还提供所述金纳米颗粒l-aunp@tmt、所述光敏剂或所述试剂盒在以下任一项或几项中的应用：

46、1)细胞器结构和/或功能发生改变；

47、优选的，包括线粒体产生大量活性氧、膜电势降低、损坏细胞内细胞骨架、溶酶体通透性增加、细胞核发生凝集中的一种或几种；

48、2)抗原、乳酸脱氢酶和炎症因子中一种或几种的大量释放；

49、优选的，所述抗原包括三磷酸腺苷、钙网蛋白和高迁移率族蛋白b1中的一种或几种；

50、优选的，所述炎症因子包括白细胞介素-18和白细胞介素-1β中的一种或几种；

51、3)各种细胞分泌物可导致抗原提呈细胞树突状细胞的成熟；

52、4)激活免疫系统；优选为小鼠的免疫系统；

53、5)抗肿瘤免疫治疗。

54、本发明tp-pdt对小鼠的体重、血常规&血生化和重要器官组织无显著损伤，系统安全性高。

55、本发明还提供所述的使用方法、或所述的应用，用于非疾病诊断或治疗领域。

56、本发明的有益效果：

57、本发明发现发光金纳米颗粒(l-aunp@tmt)在双光子光动力学作用下，可以诱导肿瘤细胞的快速焦亡，实现肿瘤的高效杀伤。基于l-aunp@tmt双光子光动力治疗可以诱发caspase 3/gsdme介导的细胞焦亡，进而诱发机体产生强烈的抗肿瘤免疫。并且，该纳米材料兼具为ⅰ、ⅱ型光动力学机制，即在肿瘤乏氧环境下，仍然可以高效产生ros、高效杀伤肿瘤。更为重要的是，活体实验结果显示，基于l-aunp@tmt的tp-pdt可有效抑制肿瘤的生长，且治疗组50％的肿瘤达到了痊愈，且不再复发。此外，与空白对照组相比，实验组小鼠在体重、血液常规与生化指标以及组织切片h&e染色等方面均未出现异常，表明基于l-aunp@tmt的tp-pdt治疗方法具有优异的生物安全性。综上所述，开发的l-aunp@tmt的tp-pdt治疗方法，不受肿瘤缺氧微环境的影响，能够在双光子照射下有效诱发机体产生细胞焦亡介导的抗肿瘤免疫效应，实现对原发瘤的根治并有效预防肿瘤的复发和转移，是一种安全、高效且理想的肿瘤治疗策略，在肿瘤临床治疗中具有重要的应用价值。