基于金纳米颗粒-适配体缀合物的抗菌蛋白载体及其制备方法与流程

本发明涉及一种基于金纳米颗粒-适配体缀合物的抗菌肽载体及其制备方法，更具体地，涉及一种抗菌肽载体及其制备方法，创建对抗菌肽具有特异性的适配体并将其与金纳米颗粒结合以提高将抗菌肽递送至细胞内的能力。

背景技术：

1、细菌对现有的抗菌剂的耐药性逐年增加，成为全球健康领域的主要问题之一。目前，全世界对感染性疾病的研究大部分集中于选择性抑制及控制病原体的代谢或生物合成途径的抗生物质开发以及通过培养减毒病原体的疫苗开发，现有的抗生物质还同时抑制调节宿主的代谢及生物合成途径的酶，因此往往会引起副作用及毒性，并且由于其耐药性而导致它的使用受到限制。因此，急需开发一种可以在初期有效控制感染性疾病的新的范式，作为其实例，抗菌肽(antimicrobial peptides，amp)备受瞩目。

2、大部分的amp为通过静电力选择性靶向细菌膜的具有两亲性结构的阳离子肽。其中，wlbu2通过前体肽的氨基酸取代进行合理设计，使得具有理想的两亲性螺旋结构，以使上皮细胞毒性最小化的同时使抗菌特性最大化。然而，为了这种抗菌肽的递送的实用化，存在可能引发能够损害正常细胞的毒性，无法长时间储存递送药物，递送准确性低的问题。

3、本发明人在之前的研究中制备了用于抗体递送的纳米颗粒复合物，并且在基于金纳米颗粒-适配体的缀合物的抗体载体的情况下，确认到细胞内抗体递送能力得到提高且稳定性优异的效果。因此，在所述抗菌肽的情况下，也需要开发一种优异的基于纳米颗粒的载体，其具有优异的药物递送能力，并且可以解决抗菌肽可能具有的如毒性或储存稳定性等问题。

技术实现思路

1、技术问题

2、因此，本发明人锐意研究努力开发一种没有毒性，并且可以将抗菌肽(wlbu2)有效递送至细胞内并诱导表达的基因递送技术。结果，利用selex技术开发与所述抗菌肽的结合力显著提高的适配体，为了将其有效递送至体内，通过共价键与纳米颗粒(aunp)一起引入以形成复合物，然后与抗菌肽(wlbu2)结合，从而完成可以将抗菌肽稳定地递送至体内的本发明。

3、因此，本发明的目的在于，开发一种能够与纳米颗粒结合的抗菌肽的靶适配体，并提供一种包含金纳米颗粒物质的抗菌肽载体。

4、本发明的再一目的在于，提供一种抗菌肽载体的制备方法，所述方法包括如下步骤：制备对抗菌肽具有特异性的适配体；以及将所述适配体与金纳米颗粒结合。

5、本发明的另一目的在于，提供一种抗菌剂组合物，其包含所述抗菌蛋白载体。

6、技术方案

7、为了实现如上所述的目的，本发明提供一种抗菌肽载体，其包含作为能够与通过selex技术制备的纳米颗粒结合的抗菌肽的wlbu2的靶适配体及金纳米颗粒物质。

8、为了实现本发明的再一目的，本发明提供一种抗菌肽载体的制备方法，所述方法包括如下步骤：制备对作为抗菌肽的wlbu2具有特异性的适配体；以及将所述适配体与金纳米颗粒结合。

9、为了实现本发明的另一目的，本发明提供一种抗菌剂组合物，其包含所述抗菌蛋白载体。

10、以下，将详细说明本发明。

11、作为本发明一实施方式，本发明涉及一种抗菌肽载体，其包含能够与纳米颗粒结合的抗菌肽的靶适配体及金纳米颗粒物质。

12、在本发明中，所述“纳米颗粒(np，nanoparticle)”是指具有纳米级直径的金属颗粒，优选地，是指“金纳米颗粒”，本发明的金纳米颗粒有利于渗透到作为靶标的细胞内以起到将肽递送至细胞内的作用。

13、所述金纳米颗粒不仅容易以稳定的颗粒的形式制备，而且其大小可以根据使用目的在0.8nm至200nm之间多样变化。并且，金可以通过与如肽、蛋白质、核酸等各种类型的分子结合来改变结构，并且在各种波长下反射光，从而可以利用其容易地确认细胞内的位置。并且，与锰、铝、镉、铅、汞、钴、镍、铍等重金属不同，金纳米颗粒对人体无害，因此具有高生物相容性，并且具有非常少的细胞毒性的优点。

14、当金纳米颗粒的直径增大至100nm以上时，不仅作为纳米粒子的特性消失，而且不具有纳米物质的特性的金表面与如硫醇基等官能团的结合变弱，直径为10-20nm以外的金纳米颗粒引起细胞毒性，因此本发明的金纳米颗粒的直径优选为10～20nm。

15、在本发明中，所述“适配体(aptamer)”为短长度的低聚体(oligomer)，是一种形成稳定的结构并具有对靶物质以高结合力及特异性进行结合的特征的单链核酸，通过分子内氢键形成特有的三维结构。可以通过这种空间结构与靶标特异性结合。可以利用指数富集配体系统进化技术(systematic evolution of ligands of exponential enrichment，selex)开发适配体，对靶标具有高亲和性及特异性，因此可以开发能够与蛋白质、糖、核酸、金属离子等各种靶标结合的适配体。

16、本发明的抗菌蛋白wlbu2可以与seq id no：2至seq id no：5的氨基酸序列或所述seq id no：1至4的氨基酸序列具有70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、97％以上或99％以上序列同一性。公知的wlbu2蛋白结构主要由arg(13个残基)及val(8个残基)组成，疏水性侧具有3个trp残基彼此被7个以上氨基酸隔开的结构，因此具有两亲性特征。

17、本发明的所述wlbu2可以对革兰阴性菌、革兰阳性菌、抗生素耐药性革兰阴性菌及抗生素耐药性革兰阳性菌具有抗菌活性。

18、所述“革兰阴性菌”包括具有内毒素(endotoxin)的所有类型的革兰阴性菌，例如，包括埃希氏菌(escherichia)属、假单胞菌(pseudomonas)属、不动杆菌(acinetobacter)属、沙门氏菌(salmonella)属、克雷伯氏菌(klebsiella)属、奈瑟氏球菌(neisseria)属、肠杆菌(enterobacter)属、志贺氏菌(shigella)属、莫拉氏菌(moraxella)属、螺杆菌(helicobacter)属、寡养单胞菌(stenotrophomonas)属、蛭弧菌(bdellovibrio)属、军团菌(legionella)属菌株等，并且不限于此。

19、所述“革兰阳性菌”可以包括葡萄球菌(staphylococcus)属、肠球菌(enterococcus)属、链球菌(streptococcus)属、梭菌(clostridium)属菌株，但不限于此。

20、并且，“抗生素耐药性革兰阳性菌”可以包括例如，甲氧西林(methicillin)耐药性革兰阳性菌、卡巴培南(carbapenem)耐药性革兰阳性菌、万古霉素(vancomycin)耐药性革兰阳性菌、大环内酯(macrolide)及多重耐药性革兰阳性菌等，“抗生素耐药性革兰阴性菌”可以包括例如，链霉素(streptomycin)耐药性革兰阴性菌、粘菌素(colistin)耐药性革兰阴性菌、卡巴培南(carbapenem)耐药性革兰阴性菌、氯霉素(chloramphenicol)耐药性革兰阴性菌、四环素(tetracyclines)耐药性革兰阴性菌、头孢霉素(cefotaxime)耐药性革兰阴性菌、超广谱β-内酰胺酶(esbl；extended spectrum beta lactamase)耐药性革兰阴性菌、替加环素(tigecycline)耐药性革兰阴性菌及多重耐药性革兰阴性菌等，并且不限于此。

21、更具体地，本发明的抗菌肽对其具有抗菌活性的菌可以为选自由铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumanii)、戈登链球菌(streptococcus gordonii)、具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum)、牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis)、土拉热弗朗西斯菌(francisella tularensis)、鼠疫耶尔森菌(yersinia pestis)、类鼻疽伯克霍尔德菌(burkholderia pseudomallei)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、mrsa、屎肠球菌(enterococcus faecium)、克雷白氏肺炎杆菌(klebsiella pneumoniae)、阴沟肠杆菌(enterobacter cloacae)、大肠杆菌(escherichia coli)、念珠菌种(candida species)组成的组中的一种以上菌。

22、为了将所述抗菌肽递送至靶细胞，本发明的抗菌蛋白载体包含与金纳米颗粒及所述抗菌肽结合的适配体。本发明的载体中包含的适配体包含用于与抗菌肽wlbu2特异性结合的核酸序列，所述适配体与金纳米颗粒的表面结合以起到介导抗菌蛋白与金纳米颗粒的结合的作用。

23、本发明的抗菌蛋白载体包含与对抗菌肽wlbu2具有特异性的适配体结合的金纳米颗粒，这提高所述抗菌肽的细胞递送力，并且可以用作利用wlbu2的抗菌剂的用途。

24、作为本发明一实施方式，本发明涉及一种抗菌蛋白载体的制备方法，所述方法包括如下步骤：开发对wlbu2具有特异性的适配体；以及将所述适配体与金纳米颗粒结合。

25、作为本发明另一实施方式，本发明涉及一种用于抗菌的组合物，其包含所述抗菌蛋白载体。

26、本说明书中使用的术语“用于抗菌的组合物”为具有抑制如细菌或霉菌等微生物的生长的活性的组合物，可以包括用于需要抗菌效果的各种领域的所有形式，例如，可以为药品、化妆品、医药部外品、兽药、食品添加剂或饲料添加剂等形式。

27、所述用于抗菌的组合物包含本发明的抗菌蛋白载体，可以广泛用作抗微生物制剂、抗病毒制剂及抗真菌剂。应用范围包括对植物、动物及人类广泛危害的病毒，用于抗菌的组合物的抗菌对象包括革兰阴性菌、革兰阳性菌、抗生素耐药性革兰阴性菌及抗生素耐药性革兰阳性菌等，可以应用于细菌、酵母菌及原生动物。本发明的所述抗菌剂组合物可以单独使用，还可以根据用途与其他抗生素一起使用。并且，除了药学用途以外，可以有用地用作食品添加剂、化妆品、软膏或注射剂等用途。

28、发明的效果

29、本发明为包含与对抗菌肽wlbu2具有特异性的适配体结合的金纳米颗粒的抗菌蛋白载体，这具有通过提高所述抗菌肽的细胞递送力能够使对靶标的抗菌效果最大化的效果，因此可以用作利用抗菌蛋白的抗菌剂的用途。